Aurora Ultimate 悉尼大学技术说明

使用 Aurora Ultimate 色谱柱对福尔马林固定石蜡包 埋的肿瘤样品进行蛋白质组学分析 技术说明 Vo Van Anh Pham、Matthew J. McKay、Mark P. Molloy 悉尼大学科林研究所，肠癌与生物标志物实验室 临床组织通常被处理成福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 的组织块，这些组织块可以被切片用于组 织病理学分析。这些存档的样品非常稳定，当与成 熟的临床数据相匹配时，为生物标志物的发现提供 了契机。目前已开发出从 FFPE 组织块中提取肽段 并利用液相色谱-质谱联用 (LC-MS/MS) 进行分析 的蛋白质组学方法。在 LC-MS/MS 分析之前，我们 结合激光显微切割 (LMD) 技术来特异性地切取 FFPE 结直肠癌样本中的肿瘤区域和正常粘膜。 我们使用从 FFPE 中提取的癌症样品和 HeLa 细 胞裂解液，评估了 IonOpticks Aurora Ultimate 色 谱柱的性能。将激光显微切割的样品分离、处理并 用胰蛋白酶消化。样品在 HF-X Orbitrap 质谱仪上 使用数据非依赖性采集 (DIA) 模式进行采集。数据 使用 DIA-NN 1.9.2 进行处理。通过该分析，从单次 1μg HeLa 进样中鉴定出 6,000 种唯一蛋白质和 74,000 条肽段。实现这一点的同时，仍保持了低变 异系数 (CV)、7 秒的半峰全宽 (FWHM) 峰宽和稳 定的保留时间。 IonOpticks Aurora Ultimate 色谱柱与 Q-Exactive HF-X 质谱仪的结合，能够从多种不同组织中鉴定 出广泛的肽段和蛋白质，并获得一致的结果，从而 能够可靠地鉴定与癌症生物学相关的标志物。 介绍 通过激光显微切割获取样品，切割面积约为 100 × 10⁶ μm²，可从直肠癌和邻近正常组织样品获 得约 20μg 的蛋白质 (图 1)。消化后的样品使用 StageTips 进行纯化，然后重悬于 0.1% FA 中。 样品使用 Thermo Fisher Scientific Dionex Ultimate 3000 进样，流速为 400 nL/min。液相色谱 (LC) 与 IonOpticks Aurora Ultimate 色谱柱 (25 cm x 75 μm) 连接。数据采集在 Thermo Fisher Q-Exactive HF-X 混合四极杆-Orbitrap 质谱仪上 进行，LC 运行时间为 140 分钟。纳升级喷雾离子源 设置为正离子模式。 方法 将脱盐后的肽段以阶梯梯度方式上样至色谱柱，起始 缓冲液浓度为 2% 的 B 液 (80% ACN, 0.1% FA) 和 98% 的 A 液 (0.1% FA)，结束时为 95% 的 B 液和 5% 的 A 液。 宽窗口数据非依赖性采集 (DIA) 数据通过一次全扫 描质谱图，随后是 50个 25 m/z 的 DIA 窗口，接着是 另一次全扫描，然后是另外 50个 25 m/z 的窗口，并 且每个 m/z 窗口与第一个循环重叠 50%，最终形成 总共 101个 m/z 窗口。全扫描质谱图在 30,000 分辨 率下采集，扫描范围为 395-1005 m/z。自动增益控制 (AGC) 目标值为 3×10⁶，最大注入时间为 55ms。 所有全扫描质谱图均以质心模式采集。每个 DIA 窗 口使用 15,000 的分辨率采集，隔离窗口宽度为 12 m/z，扫描质量范围为 395-1005 m/z。AGC 目标 值为 1×10⁶，最大注入时间为 25ms。归一化碰撞能 量 (NCE) 设置为 27，默认电荷态设置为 +2。所有 DIA 质谱图均以质心模式采集。 数据通过 DIA-NN 1.9.2 进行分析，该软件利用神经 网络，使用伪数据库以 1% 的假发现率 (FDR) 来鉴 定和定量肽段。用于预测肽段和生成谱图库的数据 库是 2023 年 10 月从 UniProt 生成的人类蛋白质 FASTA 数据库，其中包含 20,434 个条目。 图 1: (1) LMD 切割前的患者样品。(2) 患者样品，其中肿瘤区域 (红色) 和邻近正常组织 (绿色) 已被标注， 准备进行显微切割。(3) 患者样品，所有目标组织均被切割并收集到 0.6 mL 管盖中，切片上残留有肌肉/脂肪 组织。放大倍数 2.5x。 (1) 切割前 (2) 标注目标区域 (3) 组织已切割 使用激光显微切割 (LMD) 技术实现空间富集的 H&E 染色结直肠肿瘤代 表性图像。 IonOpticks 技术说明：使用 Aurora Ultimate 色谱柱对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品进行蛋白质组学分析V01.0 P 01

结果 图 2: 使用 1μg 的 HeLa 胰蛋白酶酶解物 (n = 4)。对于激光显微切割的 样品，收集了原发性结直肠肿瘤和邻近正常粘膜 (n = 3 个样本)。所有已鉴 定肽段的平均半峰全宽 (FWHM) 为 7 秒。 样品在 Thermo Fisher Scientific Dionex Ultimate 3000 和 Thermo Fisher Q-Exactive HF-X 质 谱仪上，使用 IonOpticks Aurora Ultimate (25 cm x 75 μm) 色谱柱运行， LC 运行时间为 140 分钟，流速为 400 nL/min。数据使用 DIA-NN 1.9.2 进 行分析。 三种样品类型中的唯一肽段鉴定数量 三种样品类型中的唯一蛋白质鉴定数量 图 3: 使用 1μg 的 HeLa 胰蛋白酶酶解物 (n = 4)。对于激光显微切割的 样品，收集了原发性结直肠肿瘤 (n = 3) 和邻近正常组织 (n = 3)。样品在 Thermo Fisher Scientific Dionex Ultimate 3000 和 Thermo Fisher Q-Exactive HF-X 质谱仪上，使用 IonOpticks Aurora Ultimate (25 cm x 75 μm) 色谱柱运行，LC 运行时间为 140 分钟，流速为 400 nL/min。数据使用 DIA-NN 1.9.2 进行分析。 图 5: 火山图显示了早期结直肠癌的肿瘤与邻近正常组织样本之间的差异 表达蛋白。由绿色和橙色点表示的差异表达蛋白被定义为 p 值 <0.05 且 Log2 倍数变化 (FC) >1 的蛋白质。垂直虚线表示 Log2 FC 在 ±1 的截断 值。水平虚线表示 -Log10(p-value) 在 1.3 的截断值。统计使用学生 t 检验， p 值 < 0.05 被认为具有显著性。 差异表达蛋白 不同样品类型的变异系数 图 4: HeLa 和结直肠肿瘤样品中，所有样品中均鉴定出的蛋白质的变异系数 (CV) 小提琴图。使用 1μg 的 HeLa 胰蛋白酶酶解物 (n = 4) (中位 CV = 8.06%)。 对于激光显微切割的样品，收集了原发性直肠肿瘤 (n = 3 个样本) (中位 CV = 24.1%) 及其对应的邻近正常组织 (n = 3 个样本) (中位 CV = 19.25%)。样品在 Thermo Fisher Scientific Dionex Ultimate 3000 和 Thermo Fisher Q-Exactive HF-X 质谱仪上，使用 IonOpticks Aurora Ultimate (25 cm x 75 μm) 色谱柱运行，LC 运行时间为 140 分钟。虚线代表每个样品的中 位值。数据使用 DIA-NN 1.9.2 进行分析。 下调蛋白 上调蛋白 通过使用从 FFPE 存档的结直肠癌生物样本中提取的蛋白质，成功地展示了 IonOpticks Aurora Ultimate 色谱柱与高分辨率 LC-MS/MS 在数据非依赖性采 集模式下的深度蛋白质组覆盖度和高灵敏度。 结论 Aurora Ultimate 25x75 集成式喷针色谱柱 部件号 AUR3-25075C18A (25 cm x 75μm 内径，1.7μm C18) 相关产品 IonOpticks 技术说明：使用 Aurora Ultimate 色谱柱对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样品进行蛋白质组学分析V01.0 P 02 HeLa 肿瘤 正常 0 50 100 150 变异系数 (%) -5 0 5 0 1 2 3 4 5 Log2 倍数变化 (肿瘤 / 正常) -Log10 (p 值) HeLa 肿瘤 正常 0 2,000 4,000 6,000 4,306 4,853 5,999 唯一蛋白质鉴定数量 HeLa 肿瘤 正常 0 20,000 40,000 60,000 80,000 24,997 28,947 74,253 唯一肽段鉴定数量