乔亮组新进展：基于深度学习提高DDA MS1鉴定能力

复旦大学化学系乔亮老师又发新文！文章题目：Deep Learning Powers Protein Identification from Precursor MS Information，发表期刊：Journal of Proteome Research。该文章开发了一个新方法，MonoMS1，基于深度学习和逻辑回归，可以支持从DDA数据的MS1信息中进行蛋白鉴定。文章将这个方法应用于大肠杆菌、人血清和单细胞蛋白质组分析。结果发现，MonoMS1在MS1 feature鉴定方面有显著提高，在血清和单细胞数据集中，MonoMS1也补充了肽和蛋白的鉴定数量。

基于LC-MS的肽水平鉴定依赖于一级质谱(MS1)获得的准确分子量和二级质谱(MS2)获得的碎片信息。然而，目前应用广泛的数据依赖性采集(data-dependent acquisition, DDA)，在MS2扫描中可能无法选择低丰度feature，从而导致缺失值、碎片的半随机性和高丰度肽段的重复采集。这种情况在分析low-input的样本或动态范围较宽的样本时更为明显。尽管DIA技术可以采集所有母离子的所有碎片，但全部母离子的鉴定仍受到现有数据分析策略的限制，也有上限。因此，本文开发了基于DDA数据的MS1鉴定方法，提高MS1 feature的鉴定能力，补充MS2的鉴定深度。

接下来，我们来看下MonoMS1方法的工作流程和分析应用吧！

一、MonoMS1工作流程概述

MonoMS1方法，通过整合四个维度的信息来鉴定MS1 feature，包括肽的分子量、离子迁移率、保留时间和可检测性。其中，后三个信息是通过深度学习进行预测的。随后，使用逻辑回归模型为每个维度信息分配不同的权重，以实现肽的鉴定，并利用MS2鉴定的feature来训练该模型。为了确保结果的可靠性，研究团队还采用了reference-decoy方法在feature和肽水平上评估FDR（假发现率），应用于大肠杆菌、人血清和单细胞蛋白组。

（对于大肠杆菌，用先前鉴定的48783条肽段，对应4014个大肠杆菌蛋白作为reference库，其诱饵库为HeLa肽段序列。对于人血清，用先前报道的27250条肽段，对应2617个蛋白质作为reference库，这是采用去除高丰度和色谱分馏的方式鉴定到的结果，其诱饵库为大肠杆菌。对于单细胞，选择来自相同细胞群的70638条肽段作为reference库，其诱饵库为大肠杆菌。decoy库与reference库1:1混合。）

此外，研究整合了Ivanov等人开发的二项模型计算蛋白质评分，能够提高肽鉴定的准确性，并更有效地建立肽质量控制。

二、利用大肠杆菌数据集评价MonoMS1

在本研究中，研究团队利用timsTOF Pro获取的HeLa细胞DDA数据来训练深度学习模型，并使用训练后的模型预测肽段的各种信息。结果显示，在大肠杆菌数据集中，预测的iRT与实验iRT之间的Pearson相关系数均超过0.99，离子迁移率的预测，双电荷母离子的Pearson相关系数也达到了0.99。这些结果表明，深度学习模型在iRT和离子迁移率的预测中表现出极高的准确性，甚至与最近开发的深度学习工具（如DeepLC和DIA-NN）相当或更优（图S3）。这为基于MS1的多肽鉴定提供了可靠依据。

DeepLC和DIA-NN预测的iRT和离子迁移率与实验的相关性

相较于传统的基于MS2的鉴定方法，MonoMS1在MS1 feature 鉴定方面提升了114%到141%。基于reference-decoy评估，MonoMS1 feature 鉴定准确率达到96.1%。即使在肽FDR 1%的条件下，MonoMS1仍能补充鉴定到21,965个feature，且准确率为99.2%（图2b）。这些结果表明，MonoMS1能够充分利用MS1来增加肽和蛋白质鉴定数量。如图2c所示，MonoMS1在肽FDR 5%条件下补充鉴定了8,985个肽，在肽FDR 1% 条件下，补充鉴定了6,268个肽。此外，MonoMS1还成功在肽水平FDR 5%和1% 条件下补充鉴定了366和79个蛋白质（图2c）。

为进一步验证MonoMS1补充鉴定肽的准确性，研究团队还采集了同一样本的DIA数据进行评估。结果显示，在1%肽水平FDR下，DIA方法与MonoMS1补充鉴定的结果有近一半的重叠；在5%肽水平FDR下，DIA与MonoMS1补充鉴定也有相当大的比例覆盖。需要注意的是，MonoMS1补充鉴定到而DIA未鉴定到的肽并不一定是不准确的，因为DIA虽然采集了所有母离子的所有碎片信息，但全部母离子的鉴定仍受到现有数据分析策略的限制，DIA也有局限性，所以开发MonoMS1提高DDA MS1鉴定能力、补充MS2鉴定深度也是有必要的。

三、用MonoMS1分析人血清蛋白质组

在血清蛋白质组学研究中，由于血清中蛋白质含量的动态范围非常宽，检测低丰度蛋白质一直是一个巨大的挑战。低丰度蛋白质仅能在MS1上产生微弱的信号，而难以获得相应的MS2信息。为解决这一问题，研究团队将MonoMS1方法应用于人血清数据，利用MS1 feature来补充多肽和蛋白质组的鉴定。在这些样品中，加入了PQ500稳定同位素标记的参考肽，作为评估MonoMS1鉴定准确性的手段。

结果显示，与基于MS2的方法相比，在肽水平5% FDR下，MonoMS1补充鉴定了15,252个MS1 feature，在1% FDR下补充鉴定了11,310个MS1 feature，基于reference-decoy方法评估准确率，高达98%和99.7%（图3a）。这使MonoMS1有效补充了MS2方法的肽和蛋白质鉴定（图3b）。具体来说，MonoMS1在5% FDR下鉴定了3,407个肽，其中1,282个是特有鉴定；在1% FDR下共鉴定出2,297条肽，其中534条为MonoMS1特有鉴定。在蛋白质水平上，MonoMS1同样能够补充MS2的结果。

采用PQ500同位素标肽对MonoMS1方法进行验证。研究发现，MS1 feature 在预期的质量偏移处表现出明显的同位素峰，这验证了MonoMS1的鉴定准确性（图3c）。当肽FDR设定为5%时，在鉴定的1,174个MS1 feature 中，有1,071个（91.2%）被match为PQ500同位素标肽；当FDR设定为1%时，这一比例为92.1%（图3d）。需要指出的是，没有同位素峰并不一定意味着鉴定不准确，这可能与样品浓度不足或分离效率不高有关。整体结果表明，MonoMS1 feature 鉴定可靠性超过了91%。

为了进一步评估MonoMS1的定量准确性，研究团队分析了血清样本在三次技术重复中的肽和蛋白质定量CV（图3e）。在1% FDR条件下，基于MS2的方法与MonoMS1方法的肽定量中位CV均小于10%，在蛋白质结果中，MonoMS1的中位CV为5.54%，比MS2的更低。低CV值进一步验证了MonoMS1在肽和蛋白质水平上具有较高的定量准确性。

四、MonoMS1分析单细胞蛋白质组

在单细胞蛋白质组学研究中，由于单细胞内蛋白质含量低，导致许多MS1 feature未被充分利用。为解决这一问题，研究团队将MonoMS1方法应用于单细胞数据集，充分挖掘MS1数据，补充肽和蛋白质的鉴定。该研究的单细胞数据集包含6组实验，分别为1到6个HeLa细胞，每组进行了4个技术重复。

研究结果表明，MonoMS1在肽水平1% FDR和5% FDR的标准下，都能够补充DDA数据MS1 feature的鉴定，并在所有6组数据集中表现出较高的准确性（图4a）。进一步分析显示，MonoMS1显著增加了单细胞中肽（图4b）和蛋白质（图4c）的检测数量。如图4d-f所示，基于MS2和MonoMS1的鉴定结果在6个细胞的重复实验中均展示出较高的定量精度和准确度，证明了MonoMS1在单细胞水平上具有可靠的蛋白质鉴定能力。通过利用这些MS1 feature，MonoMS1不仅补充了现有的肽和蛋白质检测结果，还保持了良好的肽FDR控制，为单细胞蛋白质组学研究提供了有力支持。

好了，以上就是今天的内容。假如你正在或者将要开展DDA蛋白质组学方面的课题，MonoMS1可以助你鉴定到更多更丰富的蛋白/肽段信息，MonoMS1的源代码可以在GitHub上免费访问(https://github.com/lmsac/MonoMS1)。

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