蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）一直是蛋白质组研究中最重要的内容之一，现今也有多种方法可在蛋白质组规模上分析PPI，但研究内源性细胞膜上的相互作用蛋白仍然是一个挑战，主要原因有两个：1. 跨膜蛋白通常丰度较低；2. 膜蛋白之间的相互作用通常是瞬时且较弱的。通常的方法包括亲和纯化质谱（AP-MS），膜蛋白酵母双杂交等，这些方法的局限在于：过表达带来生理性互作的改变；酵母系统难以反映哺乳动物真实生物过程；以及为了去除非特异性结合，使用严格的洗脱步骤，可能导致弱相互作用的丢失。
2024年9月3日，上海科技大学水雯箐课题组联合庄敏课题组，在Nature子刊《Nature Chemical Biology》发表论文”Endogenous cell membrane interactome mapping for the GLP-1 receptor in different cell types“， 该文章开发了一种基于配体的邻近标记和DIA定量蛋白质组的联合策略，不需要过表达，也不需要抗体，直接检测天然细胞中的互作蛋白。
标记酶的融合：将一种邻位标记酶（如过氧化物酶，PEX）基因融合到目标蛋白质的特定区域。 酶催化反应：加入特定的酶底物（如生物素-酚），酶会催化底物与邻近的蛋白质发生化学反应，使其被标记。 标记捕捉：通过后续的亲和捕捉步骤（如中性亲和素），结合质谱蛋白质组技术，可以分离和分析那些与目标蛋白质相邻的标记蛋白质。
本研究实验流程与膜蛋白捕获方法
探针制备：首先，将GLP-1肽与PEX融合，制备成邻位标记探针（GLP-1–PEX）。
处理细胞：将表达GLP-1R的活细胞与GLP-1–PEX探针处理。探针中的GLP-1肽与GLP-1R结合并激活受体，引发信号反应。
邻位标记：在细胞处理期间，添加底物生物素-酚和H2O2，在PEX催化下，底物与邻近蛋白发生反应，使其被标记。
捕获膜蛋白：由于GLP-1–PEX探针主要靶向GLP-1R的胞外配体结合位点，并且生物素-酚与细胞孵育时间非常短（1分钟），从而减小了膜穿透的可能，因此，标记主要发生在细胞膜上，该方法能够有效地捕获与GLP-1R密切相互作用的膜蛋白。
研究方法：
1.邻近标记：细胞样本使用探针处理5 min。然后在含有生物素-酚和H2O2的培养基中孵育1分钟，以实现邻近蛋白标记。细胞样本设置3组处理，分别为GA组（GLP-1–APEX2探针）、对照组（PBS）、探针竞争对照组（GA+GLP-1），每组3个生物学重复。
2.质谱分析：将上述细胞裂解，使用中性亲和素珠从细胞裂解液中下拉标记蛋白。标记蛋白质经过胰蛋白酶消化。使用DIA-MS方法进行更稳定可靠的蛋白定性定量。
研究结果：
通过DIA-MS分析，GLP-1-APEX2处理后，在INS-1E β细胞和SK-N-SH细胞中分别鉴定到1205和1287个邻近标记细胞膜蛋白，且实验组与对照组存在显著差异。
比较GLP-1-APEX2探针组与对照组、探针组与竞争组：在INS-1E β细胞中，探针组富集到294种GLP-1R的潜在细胞膜互作蛋白，而130种的标记强度被GLP-1竞争。这些数据帮助确定了GLP-1R的潜在互作蛋白，并且，GLP-1-APEX2探针在不同细胞类型中揭示了不同的GLP-1R互作网络，反映了细胞特异性。
韦恩图分析探针识别的潜在互作蛋白与竞争蛋白的overlap：在INS-1E β细胞中108种以及在SK-N-SH细胞中16种。确定了特定细胞类型的GLP-1R互作蛋白，揭示了特异性的细胞膜蛋白相互作用。
将识别的GLP-1R互作蛋白与BioGRID数据库中的已知互作蛋白进行对比。结果仅发现4个已知的GLP-1R互作蛋白（GABBR2, ATP1B1, SLC3A2, TFRC）。说明该研究发现了大量新的GLP-1R互作蛋白。
二、绘制动态的细胞膜相互作用网络
实验方法：
1.邻近标记：用GLP-1–APEX2探针处理INS-1E β细胞，分析不同时间点（从5分钟到60分钟）的互作蛋白，以研究时间对互动网络的影响。处理后用生物素标记细胞膜上的邻近蛋白质。
2. 质谱分析：如前所述，采用DIA-MS方法对不同时间点的处理样本进行稳定准确的蛋白组定量检测。
3.免疫荧光成像：观察不同时间点的细胞表面标记信号，以评估标记的特异性和动态变化。
研究结果：
成像结果：在所有时间点上都能看到明显的细胞表面标记信号，这些信号在对照组和探针竞争条件下均未出现，说明标记的特异性。并且这一标记随着时间的推移显示出逐渐减少的趋势。
互作蛋白的强度动态变化：GLP-1R自身强度随时间逐渐降低；新发现的功能性互作蛋白Atp1b3、Slc4a4和Gipr在15分钟时强度立即下降；而Gpc4在15分钟时达到最低强度，之后逐渐上升。
互作蛋白的动态趋势聚类：根据互作蛋白的强度变化将其分类为四个不同的簇。大多数互作蛋白显示出强度随时间降低；少数互作蛋白表现出强度的波动或上升趋势。
绘制动态的细胞膜蛋白互作网络: 该研究开发的基于配体的邻近标记方法不仅揭示了新的GLP-1R调控因子，并且绘制了GLP-1R在INS-1E β细胞中的动态细胞膜蛋白互作网络。这些互作蛋白的动态变化可能与受体激活和内吞过程有关。
好了，以上就是今天的内容。该文章通过将基于配体的邻近标记技术和质谱蛋白组方法结合，深入分析了糖尿病药靶——GLP-1R的内源性细胞膜互作蛋白，揭示了细胞异质性的调控，并发现了一些新的功能调控因子，同时绘制了动态互作网络。
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