你的LCM为啥结果总是会比别人少点？

现在蛋白质组实验越来越微量，同时越来越难以评价或预测它的检测结果了。这让我们做实验前就很难给出一个准确的预期。尤其是很多时候我们在做LCM的微切割，显微镜下图像好好地，质谱结果1000个蛋白就让人非常的纠结。在我们切下FFPE的切片后如果样品处理流程几乎都一样，质谱QC都正常的情况下，那我们应该首先怀疑的是切片被污染了，尤其是角蛋白污染。一块切片的蛋白含量可能也就ng或者百pg级别，而环境中微量的角蛋白很可能沾染到样品上一点点都会产生异常高的信号。

做惯了常规样品的您可能对此缺乏直观感受。今天我们举个简单例子给你加深下印象。

譬如如下FFPE样品，尺寸100*100μm²大概包含了20个左右细胞，采用LMD切割，由我司员工佩戴帽子口罩手套完成切割和全流程提取，但环境洁净度无法达到较高的无尘级别。

你觉得大概可以检测到多少种蛋白质呢？

答案是4900PG，而对应常规提取量的对应组织大约可以检测到8000种左右PG。

查看了蛋白丰度排序，样品本身存在一部分血液污染，HBB含量遥遥领先（FFPE状态已经无法去除了），以及一部分的角蛋白。也就是可以合理推断，从8000->5000PG，除了石蜡切片在微量提取时的额外损失，样本本身血液难以去除干净外，主要影响鉴定深度的还是切割环境的严格管控，这也是我们后续需要努力改进的方向。

然后让我们来看下污染如果再严重点会如何呢？

一样的样品，但是由我们客户自行切割提取送样，LCMS检测条件一致，结果是2400PG。

可以看到角蛋白完全取代了HBB的领先地位，霸榜丰度前十名。在确认过其他步骤条件都一致后，我们基本就可以判断这个样品从5000-2500的可能原因了。

那简单从质谱角度来说角蛋白在样品中占了高比例为啥有那么大影响呢？我们可以类比血液，我们在低丰度富集后血液能测到3000-5000种蛋白质，而不富集一般只能测到800-1000种左右，其实就是因为白蛋白，IgG等高丰度在血液里扮演着类似角蛋白在微切割污染中的角色。我们一共提取了1ng的蛋白，如果里面0.5ng是各类角蛋白，不但拖累色谱分离，同时进入质谱检测的信号就会被角蛋白占据大部分，剩余的信号相应降低，同时还会被高丰度信号所抑制。

以上就是以K1C9角蛋白为例，P组为我们重新为客户处理的结果，B组为最初送样，G组为完全防护后我司处理结果的角蛋白Log2转化后的信号强度。可以看到污染组和恰当防护组的250倍左右。

以上简单例子分享让你对极微量样品的污染再提高点警惕和认识。希望后面的实验大家都看不见角蛋白（不要掩耳盗铃的把序列删掉搜库）。