单细胞蛋白质组目前都在向5000pg/cell水平稳步推进，但是任何技术一旦探究到极限的情况时就会出现平时被忽略的各种问题。单细胞水平的样品制备既需要体系温和，简单，又要确保反应充分。既要确保极高效率，又要确保尽可能少的引入污染。一旦有所失误，常规样品可以容忍我们重来，如果是珍贵的单细胞则要么得完全重来，要么就是经费砸水里。
目前单细胞蛋白质组的前处理方式大致有以下几种：
1. 流式分选+手动前处理：流式细胞仪是非常经典的细胞分选设备了，不过绝大部分流式并不会适配蛋白质的提取处理步骤，因此基本上你都得自行处理分选得到的细胞；
2. 微流控+自动化前处理：目前已有好几种微流控技术能够对细胞进行精细分选并在液滴中进行后续酶切反应；
3. 捕获技术+自动/手动前处理：无论是通过显微微切割还是毛细管捕获，均能够得到单细胞并使用极微量反应体系进行后续蛋白处理，既有传统基于LCM接手动前处理的，也可以进行单管集成式前处理（赛鹰）。
第一种方法相对费事且不稳定，暂且略过，本文主要总结下后两种技术的结果中污染蛋白丰度、来源和影响。
技术路线 | 技术特色 | 优点 | 缺点 |
微流控 | 通过液滴控制进行细胞分离、裂解、孵育 | 通量高，可以快速分离几十到上千个细胞 | 系统准备复杂，虽然分离过程相对自动化，但整个实验准备高度依赖人工。 |
捕获技术 | 通过基于视觉（肉眼、可见光或荧光，AI识别）等进行空间操作盒前处理 | 所见即所得，只会处理你需要的细胞或组织，不涉及复杂管路系统，污染易控制 | 通量较低，成本较高，人工干预过多也会造成污染 |
那么实际情况是否的确如此呢？我们进行了一番实际对比，微流控技术路线使用了今年最新发表的来自于Nature Methods的单细胞蛋白质组数据，捕获技术采用最新赛鹰细胞操控系统进行单细胞检测的结果，都进行了基于Spectronaut 19的数据分析并加入了易算整理的contaminants蛋白序列库。重点关注排名靠前（信号最强）的蛋白情况。如果污染蛋白占所有结果的信号占比较高，那么可以认为该技术路线易遭受污染或者存在污染时难以清理（假设）。
1. 分别进行directDIA（无多个细胞pool）检索，检索数据库采用swissprot human加上contaminants序列数据库同时检索，其他参数全部默认；
2. 基于默认maxLFQ定量结果进行蛋白水平定量强度排序，选择前20名中的非细胞来源蛋白进行解读（来源，含量，是否可排除）
来自微流控技术的两套数据
数据1 约80个单hela细胞的最高丰度蛋白（共定量到7000PG）
数据2 约65个单A549细胞的最高丰度蛋白（共定量到5300PG）
数据3 来自赛鹰的单A549细胞的最高丰度蛋白（共定量到6000PG）
数据4 来自赛鹰的单个人卵细胞的最高丰度蛋白（共定量到6000PG）
可以看到，来自两个不同实验室的基于相同微流控路线的单细胞蛋白质组结果虽然数量都非常理想（>5000PG），但排名前25的蛋白中大量存在非内源的角蛋白污染。而基于赛鹰（捕获技术）路线的单细胞蛋白数量做到了相当水平，但非内源蛋白质数量远远少于前者。
可以看到除了一定会过量的trypsin（胰酶的事情我们下期另外讨论），我们将主要存在的外源性角蛋白污染作为统计对象，进行丰度含量计算
污染蛋白强度占比
我们可以得出：污染蛋白占比越低，则对实验的定量准确些及可靠性影响就越小，越可能得到真实结果。
那么为何两条技术路线的污染蛋白差异如此巨大呢？在假定操作人员本身防护措施都基本到位的情况下（文献中的防护无法得知，但赛鹰的防护就是戴了个口罩和手套操作），我们认为最大的污染可能就是仪器系统（酶解前）的开机、调试、使用步骤较多，用时较长，系统结构复杂则更容易导致污染蛋白累积或难以去除。而赛鹰系统则结构极其简单（只有移液毛细管，细胞放置盘，液相进样瓶）而由于毛细管采用了每步操作前均进行清洗的水循环系统，确保毛细管随时都洁净、无污染，即使有污染进入也会马上被清洗掉。赛鹰A549实验的时候由于周围站了4个人在聊天（包括我-,-），所以污染情况略高，而oocyte实验由于仅操作员一人实验，角蛋白几乎不存在。同时整个实验速度快，步骤少，细胞取样完毕后既进入密闭设备处理成肽段直接上机，几乎没有污染可能性。
单细胞蛋白操作时用到的设备结构越简单，与细胞接触体系越容易清洁，化学反应体系越密闭，则带来的污染情况就越轻微，实验结果也越准确。
我们在考虑单细胞蛋白质组学检测方案时，这种难以快速察觉的细微问题往往会成为实验成败的因素之一哦。