--- title: "基于显微切割的空间蛋白组可以怎么切" author: "Lwang" account: "Lwang" published_at: "2024-07-01T11:20:15+08:00" captured_at: "2026-08-26T17:27:12.683702+08:00" source_url: "https://mp.weixin.qq.com/s/CcjMfeOXAexZYmcd7NGauA" --- # 基于显微切割的空间蛋白组可以怎么切 点击蓝字，关注我们 ![图片 1](images/001.png) 在单细胞生物学时代，空间蛋白质组学已成为关键领域。今天我们聚焦显微切割技术。可以从异质性的组织中精确切割并收集样本，且保留了组织空间信息。 方案设计上，怎么切可以分为以下三种： - 收集感兴趣的细胞：精确切割并收集特定类型的细胞。 - 收集感兴趣的区域（ROI）：选择并切割特定的组织区域。 - 全切片划分网格：将整个组织切片划分为M*N个网格，每个格子当作一个要上质谱的对象。 相比传统方法，显微切割的优势在于非接触式操作减少样品污染、高精度切割适用于各种组织类型、用量少特别适合稀缺临床样本。它与多组学分析高度兼容，甚至能在单细胞分辨率下进行空间异质性分析，为临床和科研带来优势。 今天精选了4篇基于显微切割的空间蛋白组学研究，逐一盘点其在不同领域的应用和发现。 --- 文献1：深度视觉蛋白质组学揭示类器官移植后转变为体内表型，推进结肠类器官研究 ![图片 2](images/002.png) 题目：Deep Visual Proteomics advances human colon organoid models by revealing a switch to an in vivo-like phenotype upon xenotransplantation 链接：https://doi.org/10.1101/2024.05.13.593888 研究团队：马克斯·普朗克生物化学研究所Matthias Mann团队 预印版时间：2024-0513 切割策略：AI引导细胞分类 + 单细胞显微切割 研究亮点：团队进一步改进了其DVP流程，除了大家耳熟能详的高分辨率荧光成像+AI引导的细胞分割和分类+单细胞激光捕获显微切割，尤其使用了新型Orbitrap Astral分析仪，提高蛋白覆盖率，体现细胞类型特异性的空间蛋白质组图谱。这个方法不需要将新鲜组织分离和富集活细胞，而是从天然状态的组织中分离很少量的细胞。 切割方案和鉴定量 样本种类：人类结肠组织切片（11个）、体外培养的类器官切片（15个）、移植到小鼠结肠的类器官切片（50个）。 切片厚度：所有样本均切成5微米厚的切片。 图像处理：通过高分辨率图像进行细胞检测，使用Cellpose软件分割图像得到轮廓（一个轮廓≈5微米组织切片中的一个细胞）。 细胞分类：使用生物图像分析软件（BIAS）对细胞进行分类，分离出上皮细胞、杯状细胞、免疫细胞和成纤维细胞。 微切割：每个细胞类型大约切割了500个轮廓也就是500个细胞；此外由于移植类器官样本量有限，从移植的样本收集大约100-200个细胞 蛋白质谱实验：Evosep One液相色谱系统 + Orbitrap Astral质谱仪 蛋白质鉴定：所有细胞总共鉴定出8865种蛋白，每个样本中位数为6780种蛋白。增加蛋白质组深度，使文章能够从分散在几张载玻片上的细胞中识别低丰度蛋白，例如 SOX9 或 LGR5。 ![图片 3](images/003.png) 人类结肠粘膜的样本 成分分析（PCA）显示，人类结肠粘膜的样本分为两大类：上皮细胞（Epithelium）和固有层细胞（PCA图示标为lamina propria，包括免疫细胞和成纤维细胞），并且根据细胞在隐窝中的位置（底部或顶部）进一步区分（图1F）。 为了确认分离出的不同细胞群体的准确性，文章还检查了样本中的已知细胞标志物。例如，隐窝顶部的上皮细胞中的高表达的KRT20蛋白，隐窝底部的上皮细胞高表达的EPHB2，杯状细胞中高表达的MUC2，成纤维细胞中的THY1，在免疫细胞中发现了高水平的分化簇（CD3E）和人类白细胞抗原（HLA-DRA），也就是说，文章根据已知marker蛋白质丰度和空间分布验证了方法可靠性。在验证了分离出的不同细胞群体的准确性之后，文章接下来重点强调了隐窝轴位置对蛋白质表达的影响。尽管样本根据细胞类型（如上皮细胞和固有层细胞）有所区分，但它们在隐窝中的位置（顶部或底部）对它们的蛋白质表达模式影响更大。 比如说ZZEF1蛋白在隐窝顶部（upper crypt）区域丰度较高，而TAGLN蛋白在隐窝底部(lower crypt)区域丰度较高。 ![图片 4](images/004.png) 既往研究已经提到【沿着隐窝轴的WNT和BMP信号传导调节上皮表型】这个现象是存在的。WNT信号在隐窝底部更强，促进细胞增殖和维持干细胞特性。BMP信号在隐窝顶部更强，抑制细胞增殖并促进细胞分化。这些是文献基础。 在本次的实验中，发现TAGLN在隐窝底部的表达显著高于其他部位，这与WNT信号在该区域的高活性相一致。同样地，观察到ZZEF1在隐窝顶部的表达显著高于其他部位，这与BMP信号在该区域的高活性相符合。基于上述实验结果和文献报道，文章推测这些蛋白质的分布可能是由WNT和BMP信号梯度决定的。 为了验证这一假设，文章设计了一系列实验。 类器官结果 首先，文章利用+WNR条件（即添加WNT替代物、R-spondin1和Noggin）培养类器官，这种条件下，类器官表现出高增殖特性但分化功能较低。接着，科研人将体外培养的类器官移植到小鼠结肠中，观察到移植后的类器官表型发生了显著变化，表现为增殖特征减少、功能特征增加，更接近体内细胞状态。这些结果支持了WNT信号在隐窝底部的活跃状态促进细胞增殖和干细胞维持，而BMP信号在隐窝顶部的活跃状态促进细胞分化。 为了进一步确认这些信号的作用，文章调整了类器官的培养条件，去除WNT信号（即不再补充WNT替代物和R-spondin1）并增加BMP信号（通过补充BMP因子）。这些调整导致类器官表型再次发生变化，具体表现为MUC17表达增加和氧化磷酸化功能的恢复。这些结果表明，WNT信号撤回确实能诱导类器官向更接近体内状态的表型转变。通过这些实验，空间蛋白质组学揭示了WNT和BMP信号梯度对表型的调控能力。 ![图片 5](images/005.png) 因此，通过空间蛋白技术，发现表型变化是由培养条件的调整引起的，而非细胞本身特性。这得益于空间蛋白质组学和单细胞取样技术，前者允许在原位环境中分析蛋白质分布，后者排除了群体异质性对结果的干扰。 文献2：标本3D成像后对组织进行蛋白质组分析 ![图片 6](images/006.png) 题目：Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens 链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.11.021 技术方案：全器官/全生物体清除和成像 + 显微切割特定区域 全器官/全生物体清除和成像：该技术利用化学方法使整个器官（例如小鼠大脑或人类心脏）或生物体（例如小鼠）透明，从而在显微镜下进行详细的三维成像。透明化的目的是为了消除光学散射，使深层结构能够被清晰观察到；通过深度学习算法，精确定位和识别目标区域 ,然后通过显微切割获取特定的小区域进行详细的质谱分析。 LCM切割方案与定量 以微创脑损伤（mTBI）小鼠模型为例。 首先，研究团队制定了适用于一个透明化的样本制备流程，通过化学处理，使小鼠大脑透明化，从而能够在显微镜下进行详细的三维成像。再通过深度学习算法分析这些图像，精确定位并识别了感兴趣的区域（ROI），例如包含局部炎症的脑区。接下来组织切割与LCM技术上场。 然后，将清除后的硬组织变软，便于进行精确的冷冻切片和LCM切割。这样他们从较大的组织区域中切割出体积约为0.0005 mm³的区域，相当于约60个细胞，并在高度灵敏的质谱平台上进行了基于MS的蛋白质组分析。 而且，为了精确定位切割区域，研究人员将2D LCM图像自动配准回3D成像，生成了重建的3D LCM结构。对于质谱实验，分析了三个ROIs（每个体积约0.0005 mm³），每个ROI中鉴定到1400种蛋白质。结果发现，在mTBI和对照组中有602种蛋白质都鉴定到。比较mTBI组内的ROIs，识别出了有717种蛋白质都鉴定到，同时每个ROI还有独特的蛋白质集合。 最后，通过主成分分析（PCA），PCA图清晰区分了mTBI和对照组的蛋白质组，发现了一些与轴突损伤和修复相关的蛋白质显著差异表达，如Stmn1和Ncan。进一步，通过免疫荧光验证了Stmn1和Ncan在mTBI脑组织中的富集。 ![图片 7](images/007.png) 很多人会问我们一个问题，到底切多大才能够分析，其实这一篇老文章给出了自己的参考答案。在微创脑损伤小鼠模型中，研究人员通过LCM技术切割出体积约为0.0005 mm³的组织区域，换算下来如果切割的区域是 200×200 μm左右，厚度大约为 10μm再多一点，他这一篇的一个采样点鉴定量一千四当然也跟2022年比较早期的质谱性能和试剂盒有关，后面的蛋白组质谱结果也可以发现一些关键的蛋白，这为相关研究提供了参考。 --- 文献3：LCM-蛋白质组学识别胶质母细胞瘤核心和浸润边缘的区域 ECM 特征 题目：LCM-Proteomics Identifies Regional ECM Signatures for Core and Infiltrating Edge of Glioblastoma 链接：https://doi.org/10.1101/2022.09.01.506199 切割组织：胶质母细胞瘤的FFPE组织 研究方案：利用LCM蛋白质组学比较胶质母细胞瘤核心和浸润边缘，识别这两个区室的蛋白ECM特征。因为LCM满足在显微镜下从组织切片中切除和收集离散区域，因此在这里会被用到。结合LCM和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行空间分辨的研究，揭示胶质母细胞瘤核心和浸润边缘的ECM组成以理解区域微环境 ![图片 8](images/008.png) - 样本厚度：提到5μm FFPE组织切片 - 区域标注：标注“肿瘤核心（C）”和“浸润边缘（E）”区域 - 切割方法：从多个切片中切割出相等体积（0.05mm³）的肿瘤核心和浸润边缘组织 - 组织收集：将切割的组织收集在MMI透明隔离帽中，并将来自同一区域的组织进行汇集 ![图片 9](images/009.png) 通过LCM-蛋白质组学在FFPE组织中识别出53种matrisome蛋白，显示出与传统的快速冷冻组织分析相当的性能 。分析显示了区域差异--脑/肿瘤界面和肿瘤中心的matrisome成分不同。肿瘤中心的纤连蛋白（fibronectin）表达较高，而脑/肿瘤界面的基质蛋白tenascin-R表达较高 。最终，通过免疫组化验证了LCM-蛋白质组学数据，结果与质谱数据一致 。 ![图片 10](images/010.png) 肿瘤核心和浸润边缘的空间异质性影响临床结果。尽管肿瘤/脑界面在显微镜下看起来与正常脑组织相似，但90%的复发发生在手术切除后的浸润边缘。利用显微切割方案联合质谱蛋白组，可以了解这些区域的ECM特征有助于开发更有效的治疗策略。 --- 文献4：空间蛋白质组学视角下的人脑肿瘤：LCM与质谱联合分析 题目：Deep topographic proteomics of a human brain tumour 链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-43520-8 研究亮点：这篇文章通过使用激光捕获显微切割（LCM）技术和质谱分析，在不同的空间分辨率中肿瘤微环境中的蛋白质分布。研究亮点在于，作者在三个不同的空间分辨率上进行采样，从整个肿瘤组织切片到40微米的分辨率。大尺度采样提供了肿瘤整体的蛋白质分布信息，而小尺度采样揭示了细胞层次的精细结构和局部环境的蛋白质表达。研究发现了肿瘤组织中的蛋白质异质性，具体体现在肿瘤实体、肿瘤/非肿瘤边界、免疫细胞浸润区域以及血管周围。 ![图片 11](images/011.png) 技术流程 首先，组织被放置在与激光捕获显微切割（LCM）兼容的载玻片上。待研究的组织样本是一种典型的异形畸胎瘤/横纹肌肉瘤（AT/RT），这是一种特殊的人脑肿瘤，从死后的患者那里获得并经授权使用。该组织样本的尺寸约为20×15毫米。在LCM分析阶段，这一组织被进一步细分为384个方形“体素”，每个体素的面积大约为694,000微米²。切片的厚度为10微米，这种厚度特别适合进行LCM操作和后续的蛋白质组分析。此外，该组织样本自身具有血管和肿瘤组织等异质性特征。 - Annotate: 组织划分-组织被划分为规则的网格形状 - Cut: LCM分离-网格中的每个元素通过LCM隔离到96孔板的一个孔中 - Lyse: 蛋白质裂解-每个样品中的蛋白质在RIPA缓冲液中被裂解 - Digest: 肽段消化-裂解的蛋白质被消化成肽段 - LC-MS/MS -消化的肽段通过质谱检测 - Proteomic Maps: 蛋白质地图-每种蛋白质的定量信息被映射回其在网格化组织中的位置，并在拓扑蛋白质地图中可视化，每种定量的蛋白质有一个地图 切片特点 - 833微米分辨率，覆盖整个肿瘤切片； - 350微米分辨率，覆盖两个明显不同区域之间的部分边界； - 40微米分辨率，覆盖几个血管及其周围的细胞。 这些分辨率表示每个采样格子的大小。 不同分辨率下的关键结果 833微米的结果着重于宏观层面的整体蛋白质分布，揭示肿瘤整体区域与正常脑组织之间的差异。提供肿瘤整体的蛋白质分布信息。通过空间数据分析发现如PYGL和PRPH等蛋白质在肿瘤与正常脑组织的交界处表现出显著的空间变化，揭示了肿瘤微环境中蛋白质表达的空间异质性。 350微米的结果聚焦于中尺度的肿瘤边界和过渡区域，展示肿瘤与正常组织交界处的蛋白质表达特征。揭示肿瘤与非肿瘤边界区域的蛋白质表达特征。聚类分析显示出连续区域，如肿瘤实体和脑/肿瘤交界处。一些蛋白如PYGL、ASPH和PRPH在功能分析中显示与细胞外基质、血管生成、免疫过程等有关。 40微米的结果详细展示血管及其周围细胞的蛋白质分布。血液蛋白与血管距离呈正相关，空间聚类将组织分为四个主要聚类，不同聚类表现出与血液相关的功能特征。 ![图片 12](images/012.png) 最后 显微切割技术在空间蛋白质组学研究中将会继续大显身手。通过选择性地切割并收集特定细胞、区域或网格样本，保留了组织的空间信息，使得样品分析更为精确。它与质谱蛋白组的联合，使研究人员能够在空间背景下解析蛋白质分布和功能，揭示疾病相关的细胞异质性和微环境特征。 相关阅读 跨平台合作：质谱、Olink与SomaScan在蛋白质组学研究中的联合策略 宏蛋白组学技术方案与实用策略盘点 - 易算团队整理 近三年Matthias Mann课题组在质谱体液蛋白组研究的启示 联系我们 CONTACT US ![图片 13](images/013.webp) 上海易算生物科技有限公司，专注于利用LC-MS/MS和生物信息学技术，为客户提供高质量的研究方案。我们与国内顶尖的蛋白质组实验室紧密合作，开发最新的蛋白质组相关技术和产品。从DIA、PRM分析产品、单细胞及极微量蛋白质前处理，低丰度蛋白深度挖掘，糖蛋白质组，宏蛋白质组整体方案实验室落地方案等，易算均有国际前沿水平并在高分杂志上发表成果的技术产品。易算自研EasyPept AUTO自动化工作站能够将步骤复杂的质谱样本前处理流程，简化为一键式操作，实现对微量临床样本蛋白质组的智能化、高通量、高重复性分析，有效解决了手工效率低、蛋白质提取损失大、富集流程不理想、所需样本量大等问题。 在数据分析和国际软件方面，我们自主研发了EasyDIA综合数据处理平台，对液相系统、质谱仪器运行状态、定性结果、定量结果等多个方面进行质控，集成了质谱定量数据分析过程中所用的统计方法，支持分析结果的交互式或静态式的展示与下载功能，有利于支撑大队列的高效运转。我们还引入了国外先进的软件和产品，包括来自瑞士Biognosys公司、德国Bruker公司、德国PreOmics公司和澳大利亚IonOpticks公司等，为国内科研机构提供先进可靠的实验及软件解决方案。