基于显微切割的空间蛋白组可以怎么切

原创 Lwang omicsolution

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在单细胞生物学时代，空间蛋白质组学已成为关键领域。今天我们聚焦显微切割技术。可以从异质性的组织中精确切割并收集样本，且保留了组织空间信息。

方案设计上，怎么切可以分为以下三种：

收集感兴趣的细胞：精确切割并收集特定类型的细胞。
收集感兴趣的区域（ROI）：选择并切割特定的组织区域。
全切片划分网格：将整个组织切片划分为M*N个网格，每个格子当作一个要上质谱的对象。

相比传统方法，显微切割的优势在于非接触式操作减少样品污染、高精度切割适用于各种组织类型、用量少特别适合稀缺临床样本。它与多组学分析高度兼容，甚至能在单细胞分辨率下进行空间异质性分析，为临床和科研带来优势。

今天精选了4篇基于显微切割的空间蛋白组学研究，逐一盘点其在不同领域的应用和发现。

文献1：深度视觉蛋白质组学揭示类器官移植后转变为体内表型，推进结肠类器官研究

题目：Deep Visual Proteomics advances human colon organoid models by revealing a switch to an in vivo-like phenotype upon xenotransplantation

链接：https://doi.org/10.1101/2024.05.13.593888

研究团队：马克斯·普朗克生物化学研究所Matthias Mann团队

预印版时间：2024-0513

切割策略：AI引导细胞分类 + 单细胞显微切割

研究亮点：团队进一步改进了其DVP流程，除了大家耳熟能详的高分辨率荧光成像+AI引导的细胞分割和分类+单细胞激光捕获显微切割，尤其使用了新型Orbitrap Astral分析仪，提高蛋白覆盖率，体现细胞类型特异性的空间蛋白质组图谱。这个方法不需要将新鲜组织分离和富集活细胞，而是从天然状态的组织中分离很少量的细胞。

切割方案和鉴定量

样本种类：人类结肠组织切片（11个）、体外培养的类器官切片（15个）、移植到小鼠结肠的类器官切片（50个）。

切片厚度：所有样本均切成5微米厚的切片。

图像处理：通过高分辨率图像进行细胞检测，使用Cellpose软件分割图像得到轮廓（一个轮廓≈5微米组织切片中的一个细胞）。

细胞分类：使用生物图像分析软件（BIAS）对细胞进行分类，分离出上皮细胞、杯状细胞、免疫细胞和成纤维细胞。

微切割：每个细胞类型大约切割了500个轮廓也就是500个细胞；此外由于移植类器官样本量有限，从移植的样本收集大约100-200个细胞

蛋白质谱实验：Evosep One液相色谱系统 + Orbitrap Astral质谱仪

蛋白质鉴定：所有细胞总共鉴定出8865种蛋白，每个样本中位数为6780种蛋白。增加蛋白质组深度，使文章能够从分散在几张载玻片上的细胞中识别低丰度蛋白，例如 SOX9 或 LGR5。

人类结肠粘膜的样本

成分分析（PCA）显示，人类结肠粘膜的样本分为两大类：上皮细胞（Epithelium）和固有层细胞（PCA图示标为lamina propria，包括免疫细胞和成纤维细胞），并且根据细胞在隐窝中的位置（底部或顶部）进一步区分（图1F）。

为了确认分离出的不同细胞群体的准确性，文章还检查了样本中的已知细胞标志物。例如，隐窝顶部的上皮细胞中的高表达的KRT20蛋白，隐窝底部的上皮细胞高表达的EPHB2，杯状细胞中高表达的MUC2，成纤维细胞中的THY1，在免疫细胞中发现了高水平的分化簇（CD3E）和人类白细胞抗原（HLA-DRA），也就是说，文章根据已知marker蛋白质丰度和空间分布验证了方法可靠性。在验证了分离出的不同细胞群体的准确性之后，文章接下来重点强调了隐窝轴位置对蛋白质表达的影响。尽管样本根据细胞类型（如上皮细胞和固有层细胞）有所区分，但它们在隐窝中的位置（顶部或底部）对它们的蛋白质表达模式影响更大。

比如说ZZEF1蛋白在隐窝顶部（upper crypt）区域丰度较高，而TAGLN蛋白在隐窝底部(lower crypt)区域丰度较高。

既往研究已经提到【沿着隐窝轴的WNT和BMP信号传导调节上皮表型】这个现象是存在的。WNT信号在隐窝底部更强，促进细胞增殖和维持干细胞特性。BMP信号在隐窝顶部更强，抑制细胞增殖并促进细胞分化。这些是文献基础。

在本次的实验中，发现TAGLN在隐窝底部的表达显著高于其他部位，这与WNT信号在该区域的高活性相一致。同样地，观察到ZZEF1在隐窝顶部的表达显著高于其他部位，这与BMP信号在该区域的高活性相符合。基于上述实验结果和文献报道，文章推测这些蛋白质的分布可能是由WNT和BMP信号梯度决定的。

为了验证这一假设，文章设计了一系列实验。

类器官结果

首先，文章利用+WNR条件（即添加WNT替代物、R-spondin1和Noggin）培养类器官，这种条件下，类器官表现出高增殖特性但分化功能较低。接着，科研人将体外培养的类器官移植到小鼠结肠中，观察到移植后的类器官表型发生了显著变化，表现为增殖特征减少、功能特征增加，更接近体内细胞状态。这些结果支持了WNT信号在隐窝底部的活跃状态促进细胞增殖和干细胞维持，而BMP信号在隐窝顶部的活跃状态促进细胞分化。

为了进一步确认这些信号的作用，文章调整了类器官的培养条件，去除WNT信号（即不再补充WNT替代物和R-spondin1）并增加BMP信号（通过补充BMP因子）。这些调整导致类器官表型再次发生变化，具体表现为MUC17表达增加和氧化磷酸化功能的恢复。这些结果表明，WNT信号撤回确实能诱导类器官向更接近体内状态的表型转变。通过这些实验，空间蛋白质组学揭示了WNT和BMP信号梯度对表型的调控能力。

因此，通过空间蛋白技术，发现表型变化是由培养条件的调整引起的，而非细胞本身特性。这得益于空间蛋白质组学和单细胞取样技术，前者允许在原位环境中分析蛋白质分布，后者排除了群体异质性对结果的干扰。

文献2：标本3D成像后对组织进行蛋白质组分析

题目：Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens

链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.11.021

技术方案：全器官/全生物体清除和成像 + 显微切割特定区域

全器官/全生物体清除和成像：该技术利用化学方法使整个器官（例如小鼠大脑或人类心脏）或生物体（例如小鼠）透明，从而在显微镜下进行详细的三维成像。透明化的目的是为了消除光学散射，使深层结构能够被清晰观察到；通过深度学习算法，精确定位和识别目标区域 ,然后通过显微切割获取特定的小区域进行详细的质谱分析。

LCM切割方案与定量

以微创脑损伤（mTBI）小鼠模型为例。

首先，研究团队制定了适用于一个透明化的样本制备流程，通过化学处理，使小鼠大脑透明化，从而能够在显微镜下进行详细的三维成像。再通过深度学习算法分析这些图像，精确定位并识别了感兴趣的区域（ROI），例如包含局部炎症的脑区。接下来组织切割与LCM技术上场。

然后，将清除后的硬组织变软，便于进行精确的冷冻切片和LCM切割。这样他们从较大的组织区域中切割出体积约为0.0005 mm³的区域，相当于约60个细胞，并在高度灵敏的质谱平台上进行了基于MS的蛋白质组分析。

而且，为了精确定位切割区域，研究人员将2D LCM图像自动配准回3D成像，生成了重建的3D LCM结构。对于质谱实验，分析了三个ROIs（每个体积约0.0005 mm³），每个ROI中鉴定到1400种蛋白质。结果发现，在mTBI和对照组中有602种蛋白质都鉴定到。比较mTBI组内的ROIs，识别出了有717种蛋白质都鉴定到，同时每个ROI还有独特的蛋白质集合。

最后，通过主成分分析（PCA），PCA图清晰区分了mTBI和对照组的蛋白质组，发现了一些与轴突损伤和修复相关的蛋白质显著差异表达，如Stmn1和Ncan。进一步，通过免疫荧光验证了Stmn1和Ncan在mTBI脑组织中的富集。

很多人会问我们一个问题，到底切多大才能够分析，其实这一篇老文章给出了自己的参考答案。在微创脑损伤小鼠模型中，研究人员通过LCM技术切割出体积约为0.0005 mm³的组织区域，换算下来如果切割的区域是 200×200 μm左右，厚度大约为 10μm再多一点，他这一篇的一个采样点鉴定量一千四当然也跟2022年比较早期的质谱性能和试剂盒有关，后面的蛋白组质谱结果也可以发现一些关键的蛋白，这为相关研究提供了参考。

文献3：LCM-蛋白质组学识别胶质母细胞瘤核心和浸润边缘的区域 ECM 特征

题目：LCM-Proteomics Identifies Regional ECM Signatures for Core and Infiltrating Edge of Glioblastoma

链接：https://doi.org/10.1101/2022.09.01.506199

切割组织：胶质母细胞瘤的FFPE组织

研究方案：利用LCM蛋白质组学比较胶质母细胞瘤核心和浸润边缘，识别这两个区室的蛋白ECM特征。因为LCM满足在显微镜下从组织切片中切除和收集离散区域，因此在这里会被用到。结合LCM和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行空间分辨的研究，揭示胶质母细胞瘤核心和浸润边缘的ECM组成以理解区域微环境

样本厚度：提到5μm FFPE组织切片
区域标注：标注“肿瘤核心（C）”和“浸润边缘（E）”区域
切割方法：从多个切片中切割出相等体积（0.05mm³）的肿瘤核心和浸润边缘组织
组织收集：将切割的组织收集在MMI透明隔离帽中，并将来自同一区域的组织进行汇集

通过LCM-蛋白质组学在FFPE组织中识别出53种matrisome蛋白，显示出与传统的快速冷冻组织分析相当的性能。分析显示了区域差异--脑/肿瘤界面和肿瘤中心的matrisome成分不同。肿瘤中心的纤连蛋白（fibronectin）表达较高，而脑/肿瘤界面的基质蛋白tenascin-R表达较高。最终，通过免疫组化验证了LCM-蛋白质组学数据，结果与质谱数据一致。

肿瘤核心和浸润边缘的空间异质性影响临床结果。尽管肿瘤/脑界面在显微镜下看起来与正常脑组织相似，但90%的复发发生在手术切除后的浸润边缘。利用显微切割方案联合质谱蛋白组，可以了解这些区域的ECM特征有助于开发更有效的治疗策略。

文献4：空间蛋白质组学视角下的人脑肿瘤：LCM与质谱联合分析

题目：Deep topographic proteomics of a human brain tumour

链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-43520-8

研究亮点：这篇文章通过使用激光捕获显微切割（LCM）技术和质谱分析，在不同的空间分辨率中肿瘤微环境中的蛋白质分布。研究亮点在于，作者在三个不同的空间分辨率上进行采样，从整个肿瘤组织切片到40微米的分辨率。大尺度采样提供了肿瘤整体的蛋白质分布信息，而小尺度采样揭示了细胞层次的精细结构和局部环境的蛋白质表达。研究发现了肿瘤组织中的蛋白质异质性，具体体现在肿瘤实体、肿瘤/非肿瘤边界、免疫细胞浸润区域以及血管周围。

技术流程

首先，组织被放置在与激光捕获显微切割（LCM）兼容的载玻片上。待研究的组织样本是一种典型的异形畸胎瘤/横纹肌肉瘤（AT/RT），这是一种特殊的人脑肿瘤，从死后的患者那里获得并经授权使用。该组织样本的尺寸约为20×15毫米。在LCM分析阶段，这一组织被进一步细分为384个方形“体素”，每个体素的面积大约为694,000微米²。切片的厚度为10微米，这种厚度特别适合进行LCM操作和后续的蛋白质组分析。此外，该组织样本自身具有血管和肿瘤组织等异质性特征。

Annotate: 组织划分-组织被划分为规则的网格形状
Cut: LCM分离-网格中的每个元素通过LCM隔离到96孔板的一个孔中
Lyse: 蛋白质裂解-每个样品中的蛋白质在RIPA缓冲液中被裂解
Digest: 肽段消化-裂解的蛋白质被消化成肽段
LC-MS/MS -消化的肽段通过质谱检测
Proteomic Maps: 蛋白质地图-每种蛋白质的定量信息被映射回其在网格化组织中的位置，并在拓扑蛋白质地图中可视化，每种定量的蛋白质有一个地图

切片特点

833微米分辨率，覆盖整个肿瘤切片；
350微米分辨率，覆盖两个明显不同区域之间的部分边界；
40微米分辨率，覆盖几个血管及其周围的细胞。

这些分辨率表示每个采样格子的大小。

不同分辨率下的关键结果

833微米的结果着重于宏观层面的整体蛋白质分布，揭示肿瘤整体区域与正常脑组织之间的差异。提供肿瘤整体的蛋白质分布信息。通过空间数据分析发现如PYGL和PRPH等蛋白质在肿瘤与正常脑组织的交界处表现出显著的空间变化，揭示了肿瘤微环境中蛋白质表达的空间异质性。

350微米的结果聚焦于中尺度的肿瘤边界和过渡区域，展示肿瘤与正常组织交界处的蛋白质表达特征。揭示肿瘤与非肿瘤边界区域的蛋白质表达特征。聚类分析显示出连续区域，如肿瘤实体和脑/肿瘤交界处。一些蛋白如PYGL、ASPH和PRPH在功能分析中显示与细胞外基质、血管生成、免疫过程等有关。

40微米的结果详细展示血管及其周围细胞的蛋白质分布。血液蛋白与血管距离呈正相关，空间聚类将组织分为四个主要聚类，不同聚类表现出与血液相关的功能特征。

最后

显微切割技术在空间蛋白质组学研究中将会继续大显身手。通过选择性地切割并收集特定细胞、区域或网格样本，保留了组织的空间信息，使得样品分析更为精确。它与质谱蛋白组的联合，使研究人员能够在空间背景下解析蛋白质分布和功能，揭示疾病相关的细胞异质性和微环境特征。