大规模临床样品TMT定量，你准备好了么？

原创 omicsolution omicsolution

前言

测试付费功能，希望大家支持

上周我们的公众号推文

为您展示了海量蛋白质组学DIA定量分析流程如何操作。

不少老师仍然对DIA心存顾虑，觉得TMT标记是个同样优秀的定量方法，也没必要一定用DIA定量，尤其是TMT分级定量的ID数量一般来说还是多于DIA单次Run的，在TMTpro能够同批次定量16个样品后，大规模临床样品的定量如虎添翼。但总的来说，TMT MS2定量准确性欠佳，TMT SPS/MS3定量损失ID数量，DIA定量对LCMS稳定性要求高，所以在课题设计阶段还是需要慎重考虑.

在您想好采用TMT定量后，肯定希望了解其中有多少需要我们注意的，应客户邀请，我们今天基于SpectroMine软件给大家展示定量近300个临床样品，含500个以上TMT run的过程及其TMT标记定量注意事项。

注意要点

除了买好TMT试剂盒外，将TMT技术应用于大样本量临床样品定量蛋白质组学时，我们有以下几个注意要点：

标记实验操作一致性：如果标记样品非常多，要严格确保标记操作的批次间一致性，否则极易产生偏差。而TMT试剂本身非常昂贵，一旦标记失误，则必然带来大量损失；

tip：如果有几十上百个样品需要进行标记，可以考虑采用PreOmics的NHS kit进行标记，平行一次处理96-192个标记样品，大大提升标记成功率和可靠性

ist-NHS方案高通量处理TMT标记样品

样品污染：临床样品采集不易，保管条件千差万别，取样手艺不一而同，DIA实验由于完全平行，故不会产生交叉污染，而TMT因为多个样品标记后混合，故污染样品容易导致整套标记出现偏差，因此样品提取后的跑胶质控至关重要；
标记后混合信号一致性：虽然TMT标记操作较为简单，但仍可能存在标记样品间混合量不一致的情况，故建议分级前先去一小部分混合上机确认通道间强度一致性；
预分级一致性：由于临床样品异质性大，个体数量多，TMT实验又必须采用分级策略进行预分级，因此如何保证预分级一致性也同样重要，稳定的常规液相色谱，可靠的常规分离柱也是需要注意的要点；
标记效率：理论上TMT标记率应该大于95%接近100%，但实际操作可能试剂批次、保存、操作等不确定性因素可能出现波动，故也需要评估；
混标reference通道，一般大于16个样品的时候您就需要将样品混合后标记一个通道，用于进行批次间的强度矫正。此时TMTPro就只能每套进行15个样品标记。但需要注意，混标reference矫正只是用于批次间信号强度归一化用，并非万能，如果样品组成差异大、一批有污染、一批没有等情况，那么混标也基本无用。尤其是注意混标样本本身不能被血液等意外情况污染，否则全部样品都会被血液干扰。

分析实操

数据下载

将客户发给我的原始数据拷贝到计算机本地硬盘

硬件准备

500多个RAW的检索对硬件的要求远没有3000个Run的DIA高，我们准备一套CPU16-32核，内存大于128GB的计算机即可。

软件准备

本次分析我们采用SpectroMine软件最新版本20210116。其能够处理海量DDA/DIA数据，并内建了和Spectronaut相似的机器学习算法，大大提高鉴定深度。数据库采用最新版本swissprot human数据库。

标记效率及定性质控

不像DIA分析直接把所有run导入spectronaut，检索完毕同时会进行质控。TMT分析我们首先从每套TMT实验抽取其中一个run进行标记效率、修饰、漏切等等质控。

Spectromine中有专门的模板用于TMT标记质控，我们只需要选择该模版，导入raw和fasta即可。

在导入完毕18个TMT数据后，略等待1小时左右，即可查看结果。

在labeling efficiency栏目中，我们依次点击每套TMT的信息即可查看标记比例以及各个通道的标记信号强度，从上图左侧柱状图可以看到，其中一套TMT的标记效率仅为55%，信号强度差异极大，表明这套实验的TMT标记失败，定量结果一定不可靠。即使有混标通道也无法挽救。

另一套标记效率约为95%，结果ok。但我们观察到其128N通道信号高于其他通道6-7倍，表明标记混合比例严重不准，依然无法得到可靠定量结果。

该套标记接近100%比例，信号强度差异最大值和最小值相差不超过100%，尚可，当然严格来说我们建议通道间信号强度极大极小值不要超过50%为佳。

漏切比例约为25%，不太理想，理想的漏切比例应该控制在5%左右。

修饰评估，未发现明显的非特异性修饰，但我们可以看到该数据的还原烷基化比例异常低，仅为1%都不到，表明烷基化操作失败，正常比例应该在5~15%左右。

质量偏差正常

观察其TIC，上图为举例，可以发现色谱柱效能正常，峰型正常，但出峰时间较晚，有效梯度比例一般。主要问题出现在背景干扰强度极高，经过观察其445信号强度普遍接近8次方，表明实验室环境较脏，对质谱数据质量有较大干扰。

定量信号丰度前20名的蛋白如上图，可以看到明显血液污染，包括白蛋白，血红蛋白及补体蛋白C3等常见的血浆、红细胞中的高丰度蛋白。

正式分析

我们直接选择Spectromine的TMTpro工作流程，导入所有RAW文件，选择fasta后，最大的工作量是指定哪些raw来自于哪套TMT，哪个标记通道属于哪组实验，哪个标记通道是pool reference。该操作可以非常轻松地通过导出的模板excel，批量填充后导入回spectromine完成。

如上图，我们只需批量指定哪些通道是group1，group2，group3（L列），哪个标记是pool reference（F列），哪些run来自于同一个Block（C列）即可完成整个实验设置。

整个分析从原始数据导入到完全分析完毕自动导出分析定量表格耗时28小时。

整个实验定量成功近13000个ProteinGroup。

进行混标通道归一化后得到如下整体定量热图

当然，该实验其他信息与我们的检索、质控步骤关系不大，同时涉及客户实验信息，此处不做展开，不过由于全部实验已经做完，该套数据是否值得继续采用，其中标记有问题的数据是否需要重新采集，则是客户需要自行斟酌的了。

结论

Spectromine软件可轻松完成数百到数千个样品的标记定量检索和分析
Spectromine软件可以快速协助我们完成标记定量所需的相关质控分析
TMT标记定量实验的前期实验设计、质控不严谨的话，就非常容易得到如本例所示的不太理想的定量结果。虽然您可以拿到10000个以上蛋白定性，但定量结果是否可靠，我们只能画个问号了。

围绕蛋白质组学定量技术，易算提供了一系列解决方案：

样品制备

PreOn 蛋白质组专用前处理工作站

Mann的首选，PreOmics iST与Spectronaut强强联手打造DIA最佳上下游方案

即插即用，性能卓越 Ionopticks色谱柱值得拥有

数据分析

起飞，Spectronaut 14 测评SpectroMine 2 于2020年HUPO发布

质量评估

利用QuiC3软件对您的质谱数据进行多层次质控

生信分析

悟空云2020年12月更新日志，元旦不要忘记学习

如有您进一步咨询需求和采购意向。