精准医学要结合临床蛋白质组数据最重要的是什么？除了配备最好的质谱，整个分析流程设计、质控及其各种细节都需要斤斤计较。

这次我们来介绍下Biognosys如何为客户德国Indivumed公司分析处理海量临床样本进行蛋白质组学分析的。

实验设计

他们的这个项目包含3345个临床冷冻切片样本（癌+癌旁），其中1715个样本来自于非小细胞肺癌病人，847例结肠癌，316例乳腺癌，206例胃癌，158例肾癌及103例肝癌样本。这些样本来自于全世界多个医院。

因此首先就得制定一个非常严格样品采集标准，包括样本切除方式的统一、保存方式的统一（切除后10分钟内必须速冻）等。

每个月他们可以收集到数百个临床样本，并交由Biognosys统一进行样品前处理，为了保证前处理的一致性，人工方式的蛋白提取显然并不可靠。他们采用自动化操作机器人，将微量样品置于96孔板内，进行同一个的破碎、裂解、还原以及酶切。每次处理92个样本，3个QC（健康人肝+肺+肠组织的标准酶解肽）样本及1个空白样本。然后采用Waters HLB Oasis96孔板进行除盐后，30ug肽段用于后续常规蛋白质组检测，500ug肽段继续采用自动化机器人进行磷酸化富集并后续用进行磷酸化蛋白质组检测。该平台每天可以处理96对蛋白质组/磷酸化蛋白质组的样本制备。

经过一系列严谨的多肽制备后，我们每天得到192个样品，因此定量蛋白质组检测流程也必须随之配套方才能不浪费前面如此巨大的投入，我们设计了基于DIA技术的定量蛋白质组检测流程对这6690个样品进行大规模数据采集。

蛋白质组分析流程

其基本实验流程包括短梯度的microflow液相-高分辨质谱DIA采集，单个样本采用45分钟蛋白质组信号采集及60分钟磷酸化蛋白质组信号采集，每天单台质谱可以采集20-30个样本，同时保证了足够的蛋白覆盖深度。

在确定了技术路线后，更重要的是样品的质控过程，如下图所示，我们采用SpectroMine软件自动对每个下机的DIA原始数据进行directDIA检索，并基于QuiC软件自动进行质控，在设定了一套严格的质控标准后（信号强度、峰宽、质量偏移、鉴定率、LC信号连续程度），不合格样品自动从后续分析中剔除。

在将另外单独进行的Pool样本分级建库数据库合并入DirectDIA结果后，我们就得到了一个规模庞大而同时超高质量的背景谱图库（不同组织分别建库），然后再采用Spectronaut软件对每个单独样品进行进一步DIA定量，并进一步对结果进行筛选统计、归一化、去除批次效应等分析后，我们就得到了一个超大规模的临床蛋白质组定量数据库了。

结果数量及CV评估

我们可以看到下图所示，45分钟短梯度DIA采集后，我们得到的平均Protein Group约6380个，平均每个样品Precuror约75000个（1%Precursor，1%ProteinGroup FDR）。