如何深入糖蛋白组的数据挖掘 | Int J Mass Spectrom |复旦大学与易算共同开发在线平台GlycAP文章发表

糖基化修饰与许多病理过程直接相关，可作为重要的候选标志物。在美国FDA批准的肿瘤标志物中，绝大部分都是糖蛋白，比如OVA1（卵巢癌）、CA125（卵巢癌）等。因此，规模化的解析糖蛋白对于发现新的诊断标志物以及治疗靶标有重要意义。

作为最复杂的翻译后修饰之一，蛋白质糖基化修饰不仅增加了蛋白质的多样性，也增加了其大规模精准解析的难度。为了探索糖蛋白的异质性并确定其丰度，对位点特异性的糖蛋白组学分析有巨大的需求。基于质谱的位点特异性糖蛋白组方法，和高效的解析软件工具已经成糖基化研究的有力策略。

然而，对数据进行系统和深入的分析仍然面临困难，因为目前主要依靠专家经验和自行开发的分析程序。如果不借助一个可靠、自动化的生物信息学工具来大规模精准数据解析，想继续深入的做糖基化研究会让很多人望而却步。

有没有这样的分析工具呢？

近日，复旦大学生物医学研究院曹纬倩团队联合易算生物，在Int J Mass Spectrom这个质谱学杂志上发表了题为“GlycAP, a glycoproteomic analysis platform for site-specific N-glycosylation research”的研究论文。文章详细介绍了一个全新的N-糖蛋白组分析平台，称为GlycAP。该平台嵌入了不同的分析模块，包括定性分析、定量分析、功能分析和临床分析，缩短了从质谱搜库结果到差异性糖肽中找到潜在的生物标志物的距离。

注：点击文末阅读原文可以进入该网站。

1、GlycAP这个平台识别什么文件和物种？

软件要求输入的是由pGlyco3【1】以及pGlycQuant【2】软件对糖肽raw文件的搜库结果。其中，pGlyco3、pGlycQuant分别对应了Qualitative analysis定性分析，以及Quantitative analysis定量分析的默认工具，这些工具都是曹老师团队开发且被多次引用， 其各自产出pGlycoDB-GP-FDR-Pro.txt和pGlycoQuant.site.list。

那么你肯定很好奇， 物种的选择有哪些？

目前GlycAP接受的物种有人（Homo sapiens），小鼠（Mus musculus），大鼠（Rattus norvegicus），拟南芥（Arabidopsis thaliana），斑马鱼（Danio rerio），酵母（Schizosaccharomyces pombe），酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ATCC），以及大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）这个最近刚刚加入的物种。

敲黑板：物种范围可以继续扩展。

2、 GlycAP的逻辑是什么？

三个层次：果核、果肉、果皮

说完输入格式，接下来我们看对于GlycAP平台的使用逻辑。GlycAP由三个层次组成。如果把GlycAP平台看做一个果子，那么分为果核、果肉、果皮，分别代表了数据层、计算层和可视化层。

第一层果核也就是数据层（Data layer），比如，帮你的糖蛋白与KEGG、Uniprot、GO、STRING数据库，形成注释好的数据。果核，是在帮你搭建起一个用于存储的内置数据库，接纳你的数据和输出结果。

第二层果肉也就是计算层(Calculation layer)，比如帮你解决糖蛋白/糖肽/糖链的统计问题，PCA，OPLSDA的分类分析，糖肽的热图聚类，富集和网络，以及ROC临床标志物诊断以及生存曲线等计算。

GlycAP的计算层，分为四大模块的16种分析流程（见下图整理）。果肉，是在负责你所有的分析工作，让你的分析内容具体而且有料。

举几个例子。比如，定性分析（Qualitative analysis）是GlycAP平台的核心模块。它用于对特定位点的糖蛋白组进行系统的表征。而很多研究都关心的糖基化的不均一性分析，用“Glycans per glycosite”来实现。我们知道蛋白质的糖基化有微观不均一性和宏观不均一性，微观不均一性指的是在一个糖基化位点上，可能出现多种糖链；而宏观不均一性指的是一个N-糖基化位点，它不是所有情况下都发生糖基化修饰的。有了这样的表征，就可以进一步识别样本在各个环境下的差异。

再比如，你还可以看到定性模块的最后一个分析：“comparison with uniprot”是什么？  是把上传文件中鉴定到的糖基化位点与uniprot记录的糖基化修饰进行比较，这个分析能够展示上传文件中糖基化位点的出处，用户可以通过这个分析知道自己鉴定到了多少新的糖基化位点。

第三层果皮也就是可视化层(visualization layer)，比如针对计算的结果给出各类条形图、饼状图、曲线图、气泡图等。果皮，是让你的分析结果得到展示，在文章里面更出彩。

比如还是上述定性分析。你的报告不光有计算结果，还有可视化的内容。

比如下图，你可以看到糖肽的基础统计，这个分析以柱形图和表格的形式展示了糖基化蛋白、糖基化位点、完整糖肽和糖链的统计数量（图2A），主要用来展示鉴定水平，评估数据质量，通过和文章或常规的鉴定数量的对比，初步判断实验结果是否达到预期。

在这里，软件会给出motif的分析结果（图2B），我们知道N-糖基化的保守氨基酸序列是N-X-S/T/C，使用motif图来展示N-糖基化位点周围的氨基酸出现频次，观察哪些图案可以被富集出来。这个分析主要是看样品中N-糖基化位点发生的规律，在什么样的肽段序列中，天冬酰胺更容易发生N-糖基化。

然后，糖链分类的分析，因为糖链的变化往往伴随着疾病的发生发展，因此我们对不同类型的糖链进行统计，能够看出不同样品糖链的变化趋势（图2C）。

之后，统计排名前20的高频次糖链，按照谱图、糖基化位点和糖基化蛋白层面对糖链进行了统计。可以看到具体的某一种糖链在样品中的丰度情况，如果有多个样品，可以监测某一个高频次的糖链在不同样品中或者疾病进程中是不是发生了丰度的变化（图2D）。除了对实验样本中的糖基化微观和宏观的不均一性（图2E和F）进行展示和统计， 最后还可以实现对上传文件中的N-糖基化位点与UniProt中记录的位点进行比较（图2G）， 用户可以直观地看到研究中发现了多少新的N-糖基化点。比如， 你在这里可以看到，在小鼠脑组织的糖肽数据中，发现了507个在UniProt中没有记录的N-糖基点。

每个分析模块，都伴随了对应的可视化图，让你的分析更有说服力。

3、如何上手这个软件？先从Demo开始。

GlycAP中有提供Demo数据的下载，你可以点击面板中的Demos进入文件下载界面，或者输入这个网址（https://project.omicsolution.com/GlycAP/?demo） 也可以进入demo下载界面，demo数据的物种是小鼠，包含了10个样本，是N糖的数据。

软件会将所有的定量数据进行sum归一化，具体方法是每个糖肽的定量值除以每个样本的所有糖肽的定量值。接下来，就供你自由DIY了。

这样的一款工具，有望推广蛋白质糖基化在临床以及其他基础科研的应用，促进促进蛋白质糖基化相关疾病机制和生物标志物的研究。

曹纬倩团队的主要研究方向是蛋白质组学和糖蛋白质组学方法开发。

早在去年10月份，复旦大学化学系乔亮团队与生物医学研究院曹纬倩团队在Nature Communications在线发表了题为“GproDIA enables data-independent acquisition glycoproteomics with comprehensive statistical control”的研究论文。文章详细介绍了一种全新的完整糖肽DIA分析工具GproDIA。该工具将以肽段为中心DIA分析的概念扩展到完整糖肽分析，通过二维错误发现率（FDR）和糖型推断算法提供全面的统计质控，实现糖肽的精准鉴定和定量。

紧接着在去年的11月份，北京中科院计算所曾文锋博士和上海复旦大学副研究员曹纬倩博士Nature Methods期刊上在线发表了题为“Precise, Fast and Comprehensive Analysis of Intact Glycopeptides and Modified Saccharide Units with pGlyco3”的研究论文。文章介绍了一种可用于完整糖肽及修饰糖精准、快速解析的工具pGlyco3。该工具提出了糖链优先的搜索策略（glycan-first search），大大提高了鉴定精度和检索速度。

为了更好的配合pGlyco3的使用， 完整糖肽定量分析的工具pGlycoQuant亦被开发和发表，可用于基于label free、化学标记和代谢标记定量策略的完整糖肽定量，目前支持pFind、pGlyco2、pGlyco3、Byonic和MSFragger-Glyco检索结果的定量。

易算生物将与曹纬倩团队继续深度合作，推进糖蛋白质组学自动化分析软件平台的普及和应用。本文第一作者是复旦大学生物医学研究院研究生吴梦溪，本文的通讯作者曹纬倩副研究员。上海易算生物科技有限公司的CEO沈诚频博士、生物信息工程师刘和斌、产品应用经理王晓庆为本课题提供了生信分析流程自动化、可视化。最后，我们希望通过这篇文章来纪念我们永远的导师杨芃原教授。

GlycAP带给用户一个糖基化蛋白质组鉴定和分析比较完善的流程化的分析平台，将常规的分析串联在一起，直接对接糖肽软件pGlyco3和pGlycoQuant的搜库结果，能简化用户使用的步骤，提高分析的自动化程度，哪怕刚入门的研究人员也能进行完整的糖基化分析。GlycAP还支持新的分析化模块和流程的引入，使得分析的灵活性也大大提高。

涉及文献

【1】Zeng, W.F., Cao, W., et al., Precise, fast and comprehensive analysis of intact glycopeptides and modified glycans with pGlyco3. Nature Methods, 2021. 18(12): p. 1515-+

【2】Cao, W., et al., pGlycoQuant with a deep residual network for precise and minuscule-missing-value quantitative glycoproteomics enabling the functional exploration of site-specific glycosylation. bioRxiv, 2021: p. 2021.11.15.468561.

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Nature Methods|中科院计算所曾文锋与复旦大学曹纬倩合作发展蛋白质位点特异性糖基化解析工具pGlyco3

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