2023年7月5日，复旦大学生物医学研究院申华丽，刘晓慧团队在《Analytical chemistry》期刊发表了一篇题为“Rapid and High-Sensitive Phosphoproteomics Elucidated the Spatial Dynamics of the Mouse Brain”的文章，该研究建立了一种高灵敏和快速的磷酸化富集方法——miniPhos。在≤100μg蛋白的情况下，20%用于蛋白组，80%纯化肽用于磷酸化富集，miniPhos方法可在4h内完成样品预处理，从仅100μg蛋白质中快速定量超过22,000个磷酸肽，甚至从低至10μg肽中鉴定＞4000个磷酸肽。该研究后续应用miniPhos方法对小鼠脑的不同微区域进行了磷酸化蛋白组和蛋白组分析，通过生信分析发现磷酸化蛋白组的区域变化比常规蛋白组更加明显。在这篇研究中，易算生物对方法开发和数据分析方面提供了支持。

文章题目：Rapid and High-Sensitive Phosphoproteomics Elucidated the Spatial Dynamics of the Mouse Brain（快速、高灵敏的磷酸化蛋白质组阐明小鼠大脑的空间动力学）

文章来源：Analytical chemistry vol. 95,28 (2023): 10703-10712.

技术路线

1.  建立一种快速、高通量且样品量少的磷酸化蛋白质组学富集方法——miniPhos

2.  将MiniPhos方法与其他商业富集试剂盒（Fe-NTA）比较

3.  将Miniphos磷酸化蛋白质组在小鼠脑切片中应用

4.  生信分析小鼠不同脑区磷酸化蛋白的动态变化


结果与讨论

1.针对微量样品的快速、简单的磷酸化富集方法


目前的磷酸化蛋白质组研究在微量样品（如罕见细胞和穿刺样品等）方面还是受样品量、重现性和稳健性的限制，因此文章建立了一种高灵敏、快速的磷酸化富集方法——MiniPhos，以期实现即使≤100μg的蛋白质样品，也能高效地检测到大量磷酸化肽段。MiniPhos做了如下优化：

● 简化了磷酸肽富集过程。整个富集过程在30 min内完成，

● 将整个反应体积缩小至20 μL，而不是目前广泛使用的StageTips (200 μL)，可有效减少样品丢失。

● 以1 M GA + 80% ACN + 5% TFA作为上样缓冲液，2 M氨水+ 30% ACN作为洗脱缓冲液，优化了磷酸肽的回收率。

通过这项技术，100μg蛋白的20%酶解肽用于蛋白组鉴定，80%酶解肽用于磷酸化富集和检测，实现微量样品的多组学分析。


2.MiniPhos优于商业富集试剂盒（Fe-NTA）

为了评估miniPhos方法的效果，实验者比较了其与商业试剂盒(Fe-NTA)的磷酸化富集效果。

● 实验策略：100μgHeLa细胞蛋白

● 结果：

miniPhos方法在富集磷酸化肽、磷酸化位点和多磷酸化肽方面都高于Fe-NTA，并且肽强度也整体高于Fe-NTA，而且仅通过miniPhos检测到的磷酸肽大多数位于低丰度。总之，使用miniPhos方法可以从100μg的蛋白中定量到22000个磷酸化肽和28000个磷酸化位点，其中13722个是class I 位点。这种高灵敏度的方法允许研究者进行大规模的生物学应用评估。


3.Miniphos磷酸化蛋白质组在小鼠脑切片中的应用

由于蛋白质活性可以通过磷酸化来动态调节，所以同时捕获蛋白质和磷酸化蛋白的动态对于全面理解细胞生物学是必不可少的。目前缺乏对小鼠脑磷酸化蛋白组和蛋白组的空间差异研究，因此文章应用了Miniphos方法，进一步探究了磷酸化蛋白组和蛋白组在小鼠脑切片空间层面的动态变化。

● 实验策略：应用miniPhos方法，结合DIA质谱采集，短梯度分离（60min）

● 样本策略：DAT-Cre:Ai140小鼠，新鲜冰冻完整脑组织，进行30μm厚的切片，4个连续切片作为生物学重复，并视为一个区域，共研究了10个脑区。

● 结果：

100μg蛋白的20%酶解肽用于蛋白组鉴定，平均每个脑区定量到近7000个蛋白；100μg蛋白的80%酶解肽用于磷酸化富集和检测，共定量了21,489个磷酸化位点，19,429个磷酸化肽段，其中磷酸化蛋白组特有鉴定到60%的磷酸化肽段。总之，磷酸化蛋白组与常规蛋白组信息更丰富，为揭示小鼠脑区域的蛋白动态调节机制提供帮助。



4.不同脑区磷酸化蛋白的动态变化


为了进一步研究蛋白质在小鼠脑内的分布，研究者分析了各个区域中磷酸化蛋白的亚细胞定位、蛋白家族占比、GSEA等。

亚细胞定位显示，磷酸化蛋白在多个神经元相关定位中表达。GSEA分析区域特征性蛋白，一个有趣的发现是磷酸化蛋白组在不同脑区的差异性远大于常规蛋白组表达的差异。具体来说，许多区域特有的蛋白质都存在磷酸化，包括52种蛋白质和281种磷酸化蛋白质，这表明磷酸化蛋白质组学分析可以为生物学研究提供更全面、更动态的信息。功能分析显示，这些区域特有的表达蛋白和磷酸化蛋白在细胞发展、能量代谢以及脑发展相关的信号过程，强调了磷酸化蛋白质组在理解大脑发展和活动中的关键作用。对每个区域特征蛋白分别进行GSEA分析，这些区域特异性蛋白在小鼠大脑中表现出不同的空间特征，这些特征可能揭示了大脑发育和相关病理的潜在机制。

5.功能通路显示小鼠每个脑区的蛋白质改变

进一步挖掘空间上的磷酸化动态变化，KEGG通路富集神经变性和癌症相关通路，将相关蛋白通过表达聚类热图和PPI网络进行可视化。

神经变性相关蛋白在不同脑区中的表达聚类分析显示，相比于蛋白表达水平（A），磷酸化位点（B）在不同小鼠脑区域展示了更加明显的变化。例如，MAP3K5的S993、Y989和Y102磷酸化位点在不同脑区高表达，而在蛋白水平上没有明显变化。

癌症通路中的蛋白和磷酸化位点网络分析显示，与上述一致，磷酸化变化比蛋白组数据更明显。如药物代谢途径中，FAS和FADD蛋白是癌症进展和炎症中的关键分子，它们仅在磷酸化蛋白质组学数据中被检测到，其中FAS蛋白在区域10的S220被磷酸化，在区域4 ~ 9的S22被磷酸化。

这些结果表明，不同区域的差异磷酸化位点可能在空间上影响大脑功能。



总结归纳

该研究突出了高灵敏和快速的Miniphos方法在磷酸化蛋白组研究中的重要性，这将吸引那些处理微量生物样本的蛋白质组学实验室。并且在小鼠脑切片的空间应用中发现，磷酸化蛋白组比蛋白组的区域变化更明显，这也提示我们通过将磷酸化位点的空间动态与蛋白质整合分析，可以深入了解细胞调控在小鼠脑不同区域之间的相互作用，这有助于更全面地理解小鼠大脑的发展和活动过程。



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