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紧接着高精度iRT预测，我们趁热打铁来聊一聊基于SpectroDive的PRM方法优化。众所周知，PRM方法优化的重点之一就是保留时间窗口的优化：保留时间的确认，窗口大小的设置都与我们结果的有效性息息相关。

SpectroDive与Spectronaut类似，也内置了保留时间校正的模块，关于保留时间校正的必要性我们之前提过，就不再重复。无论是基于Spectronaut还是SpetroDive进行谱图库构建时，软件都会进行高精度的iRT预测，每条肽段都会对应一个iRT值。因此，我们基于谱图库创建的panel中同样会包含一个iRT值，即归一化之后的保留时间，而非实际的保留时间。而我们在进行方法编辑时需要的却是实际的保留时间值，否则无法精确划分保留时间窗口。此时，我们就需要将iRT值转换成实际的保留时间值，而转换的过程必需的则是一条保留时间校正曲线。

如果我们的软件是SpectroDive 10.0以上版本，可以通过两种途径实现：

途径一：基于谱图库的校正曲线完成

采用这一途径的前提条件是：我们构建谱图库和进行PRM扫描间隔时间很短的情况下，色谱系统波动不大，离子的出峰时间都比较稳定。这时候我们可以不进行unscheduled扫描，直接采用谱图库的校正曲线来生成method也可以。操作流程：选择Panel→RT Calibration Run下选择 Import from library→选中对应的library名称→Next→勾选对应的run→Finish→OK即可，如下图：

然后设置质谱型号、色谱梯度，导出方法即可进行预实验。

进行预实验之前，需要注意以下几点：

1. 基于谱图库的校正曲线可能会有几千条肽段，我们要靶向分析的肽段只是其中的一小部分，所以由该条拟合曲线转换出的保留时间对我们的目标肽段来说并不一定是最优的，因此预实验建议窗口宽度不要小于软件给出的建议值，对于此次的demo数据，即17.73min。否则可能会有个别肽段偏离到窗口以外以至于采集不到；

2. 注意右下角软件计算的concurrent precursor的数目，即在该窗口宽度下共采集离子的最大数目，结合仪器的扫描速度，预实验尽量保证每个离子可以扫到3-4个点，如果不能满足，建议分批采集；

途径二：基于unscheduled预实验

最保险的方法是得到panel之后，先不设置保留时间窗口，采集一针unscheduled数据，以用来进行保留时间的确认。

采集完数据之后，在Analysis视图下点击“Set up Analysis for Method Scheduling…”→ 提交raw data→点击“Assign panels…”选中要分析的Panel→点击“Load”→点击“Finish”完成设置。

等待校正完成，在Prepare视图下会出现校正结果。

校正曲线是按照仪器型号及分析时间排列的，最新分析的结果最靠前，可以根据数据采集的仪器型号及时间排序找到unscheduled的预实验结果对应的保留时间校正曲线。选中对应数据后，点击Edit可以看到如下图：

绝大多数的肽段拟合的都很好，部分肽段偏离度比较大，如上图选中的肽段即校正曲线上绿色标注的点。这些点偏离校正曲线较大的原因主要有：色谱梯度波动，导致出峰时间与建库时有较大差别；提取到了假阳性的结果。具体原因可以在analysis界面去查看一下谱图人工校正。

导出scheduled 方法时，如下图，选中1,2,3, 4选择scheduled模式后，可以看到软件给出的默认window是10.43分钟，说明在这个窗口宽度内可以保证偏离较大的那几个肽段也能够被扫描到，但是10.43的window共流出的precursor是40个，要结合仪器的扫描速度和峰宽来判断下，40个是不是太多了，如果太多会导致定量的点数过少，一般尽量保证离子的定量点数10-12个最佳。如果共流出的precursor数目太多，就需要缩小一下窗口的宽度，比如改为8min或者5min，这时偏离度较大的那几个肽段就有可能偏离出窗口之外了，所以需要先确认一下这几个肽段的实际出峰时间与设置的窗口是否匹配。

对于个别偏离度比较大的肽段进行method优化主要有两种方式：

1. 直接根据校正曲线导出method表格，然后针对这几个偏离度大的肽段根据谱图手动在表格中修改一下窗口；

这个方法没有什么捷径，就针对这几条肽段一条条核对修改一下就可以

2. 在Analysis界面对这几条肽段进行人工校正，然后根据校正的结果对panel中的保留时间进行refinement，之后再重新用新的panel去分析一次预实验数据来生成一条新的校正曲线，保证所有的待检测肽段都能够很好的拟合到曲线上，然后再导出method，这时候生成的window就是比较合适的了。操作流程如下：