揭秘大脑深处：蛋白质组学绘制人脑区域精细蛋白图谱
11月2日，《The EMBO journal》期刊发表了一篇题为“A region-resolved proteomic map of the human brain enabled by high-throughput proteomics”的文章，该文章运用先进的microflow LC和timsTOF HT串联质谱技术，打造出一个高效、精准且高速的大规模蛋白质组学分析方案。研究突出了以下几点：
开发了一种FFPE样本蛋白提取高效方法，使得蛋白鉴定深度从以往的5000飞升到10000。
通过分析 ＞2,000 个连续的FFPE脑组织样本，证实了该方法的高通量应用潜力。
生成了迄今为止最全面的人脑蛋白质组图谱，涵盖 11,000 多种蛋白质。
对13个大脑区域深入分析，揭示了独特的蛋白质组学特征，并发现一些新的蛋白标志物。
文章题目：A region-resolved proteomic map of the human brain enabled by high-throughput proteomics（高通量蛋白质组学解析人类大脑区域蛋白质组图谱）
文章来源：The EMBO journal vol. 42,23 (2023): e114665.
一、优化LC-MS/MS流程
为了建立满足灵敏度、稳定性和速度要求的 LC-MS/MS 流程，该研究将microflow液相色谱系统与布鲁克 timsTOF HT质谱仪联用。为了在缩短整体分析时间的同时实现深度蛋白质组覆盖，该研究做了整体性的流程优化，包括样品制备、色谱、离子源和 MS 仪器参数。
样品制备
c：改进了SP3样本制备方法，使之适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织和脑脊液（CSF）样本，并结合自动移液平台使其实现高通量。为了更好地提取FFPE组织中的蛋白，增加了使用二氯甲烷（DCM）的脱脂步骤，提高了蛋白鉴定率7%。
色谱技术：
d\e：在液相色谱溶剂中添加了3%的二甲基亚砜（DMSO），提高了电喷雾离子化（ESI）效率，增加了32%的肽段和16%的蛋白组识别。在DMSO存在下获得的肽通常丰度较低。
离子源优化：
f-h：改进了ESI emitter，采用更小的内径设计以增强ESI效率，50μm emitter在蛋白和肽的识别上表现更佳，实现了肽段强度的三倍提升和半峰宽（FWHM）的缩小。
质谱仪参数：
优化了质谱数据采集参数，以利用microflow LC分离体系提供理想的色谱峰宽。调整MS2强度阈值和碰撞能量，提升了蛋白鉴定效率3%。
总结来说，这项研究通过精细调整样品制备和质谱分析流程，显著提升了蛋白质组分析的通量和灵敏度。
二、评估不同通量下的蛋白质组覆盖率
1. 样本：hela细胞裂解物
两个策略
数据依赖性采集（DDA）+MaxQuant软件搜库；数据非依赖性采集（DIA）+Spectronaut 17软件搜库
4个梯度上机时长
60min（24 SPD）；30min（48 SPD）；15min（96 SPD）；7.5min（192 SPD）。SPD表示每天上机的样本数量。
鉴定结果
DDA与DIA方法比较：无论最高通量（7.5min，192 SPD）还是最低通量（60min，24 SPD）：使用DIA都鉴定到更多的蛋白质，相比DDA多~2000个蛋白。
DDA和DIA的蛋白交集：上机30min（48 SPD）时，使用DIA比DDA多鉴定＞2500的特有蛋白质。
定量精确度（CV曲线）：DIA大多数蛋白的CV值都＜20%，这个定量精确度也是可观的。
2. 接下来，将评估拓展到人体体液：血液和脑脊液
上机30min（48 SPD，进样量5μg），无论血液还是脑脊液，DIA相比DDA鉴定量都提高9%
3. 分析HDAC抑制剂的靶标，抑制剂：Quisinostat和Panobinostat
方法：microflow timsTOF HT（30min）；nano Orbitrap MS/MS（110min）
图H和I展示了Quisinostat和Panobinostat对它们靶点的剂量响应曲线。图J通过相关性分析比较了这两种方法得到的EC50值，表明两种设备得到的数据在统计上具有很高的一致性。因此在检测靶蛋白和药物靶点相互作用强度方面，与nano Orbitrap MS/MS相比，microflow timsTOF HT在时间效率上有显著优势，同时保持了数据质量。
三、FFPE人类大脑区域的深度蛋白质组学分析
借助上述优化的、高通量的microflow LC timsTOF HT系统，文章接下来对人类大脑进行了区域化的蛋白质组分析。
样本：13个脑区(伏隔核NA、黑质SN、橄榄OB、丘脑THL、红核NR、海马体HPC、壳核PUT、锁核CL、尾状核CN、小脑CBM+CBw和大脑皮层CC+CCw)。从每个脑区，收集3个组织块(~5 × 5 × 5 mm)并独立处理（OB区收集2个），共38个样本，之后蛋白质提取和消化。
分级：使用高pH反相色谱将每个肽样品分48个馏分并使用30‐min方法进行microflow LC-MS /MS分析。共2271次LC-MS /MS运行数据（包括QC样本）。
质控样本评估：Hela样品中CV低于20%的蛋白质可以达到98%，
内标矫正保留时间：合成肽（PROCAL）保留时间的CV约为1%，
组织样本评估：组织样本蛋白中位CV在10-20%之间。
鉴定结果：
a.平均每个组织鉴定到9498个蛋白，所有脑区域共鉴定到11325个蛋白。
b/c.比较新鲜冷冻样品和FFPE样品，发现蛋白质表达跨度约为6个数量级。FFPE中检测到的98.6%蛋白都包含在新鲜冷冻样本中，但整体强度较低。仅在新鲜冷冻组织中检测到的大多数蛋白质位于较低的丰度。
这项研究通过高通量的蛋白质组学方法，为理解大脑不同区域的蛋白质表达提供了新的见解，并展示了高效蛋白质鉴定的技术进步。
四、脑区分辨的人类蛋白质组图谱分析
区域蛋白图谱特征：13个大脑区域检测到共有蛋白占比64%，6%是单个区域特有的，主要存在于小脑CBM、大脑皮层CC、橄榄OB和海马体HPC区。
区域特征蛋白分析：根据人类蛋白质图谱 （HPA） 原则，定义了四类区域蛋白富集分类。1 类蛋白 （593） 仅在1个大脑区域被检测到，2 类 （218） 与所有其他区域相比，在1个大脑区域中至少表达四倍的蛋白质，第 3 类 （77） 在 2-7 个大脑区域中富集至少四倍），第 4 类 （441） 在1个区域中富集的蛋白质至少是所有其他区域平均值的四倍）。CBM 区域表达的 1、2 和 4 类蛋白占比最高。相比之下，第3类蛋白在各个大脑区域之间分布更均匀，包括富集在PUT、CN和NAC区的蛋白质。这三个区域都是基底神经节的一部分。
区域样本聚类比较：tSNE分析以及分层聚类证实，解剖学上接近的大脑区域通常具有相似的蛋白质表达模式。如tSNE图中，基底神经节（NAC、CN、PUT）和中脑（NR、SN）区域的样本分别聚集在一起。
蛋白组与转录组图谱比较：有趣的是，在不同组织区域中，mRNA水平比蛋白质水平更稳定。这强调了直接测量蛋白质表达的重要性，特别是在识别某些大脑区域的标志物时，因为mRNA水平可能没有改变，但在蛋白水平发生了明显变化。
区域标志物：1 类蛋白质最可能作为区域标志物，如小脑CBM区的 MDGA1 和 SLC1A6 以及橄榄OB区中的 SBSPON 和 TPBGL。在大多数大脑区域中，发现了许多高丰度的区域标志物。
脑细胞类型特异性特征：先前发表了对主要脑细胞类型（神经元N、小胶质细胞M、星形胶质细胞A和少突胶质细胞O）基于 mRNA 表达的细胞类型特异性特征，其中许多特征也在本研究的蛋白表达中被检测到。
神经胶质细胞特征蛋白：大约 85% 的基于神经胶质 mRNA 的特征蛋白在所有脑区都被检测到，并且数量相似，例如少突胶质细胞标志物 MBP、星形胶质细胞标志物 GFAP 和小胶质细胞标志物 RGS10。其余 15% 在至少一个大脑区域中检测到，包括 OB区的少突胶质细胞蛋白 MTUS1 以及 CBM 区的星形胶质细胞蛋白 NFIA 和 NFIB。
神经元细胞特征蛋白：同样，大多数基于神经元 mRNA 的特征蛋白在所有脑区域中都检测到，包括神经元标志蛋白 CD200、SYNJ2BP 和 SPTBN4，其余 17% 存在区域富集，包括 CC 区的 MLIP 和 OB 区的 TPBGL。
脑细胞类型特征蛋白的区域分布：少突胶质细胞（O）的特征蛋白在皮质白质 （CCw） 区特别普遍，平均丰度比是其他区域平均值的 1.3 倍。白质主要由被少突胶质细胞包裹的神经元轴突组成。相比之下，神经元（N）特征蛋白在皮层（CC）区最为普遍，而大多数突触（Synapse）特征蛋白在CC区丰度较高，其次是HPC和CN。大脑皮层区前 10 种最富集的突触蛋白是 SHISA6 和 SHISA7，以及参与脊柱结构的 SYNPO 和 LRRC7。
区域富集蛋白的细胞定位：非区域富集的蛋白大多定位于细胞质或膜，而区域富集的蛋白多定位于细胞核，其次是膜、细胞质、跨膜和分泌。有趣的是，分泌和胞外基质相关蛋白在OB区高度表达。这些蛋白包括信号线索蛋白 SBSPON、ARSF 和 ANXA2。核定位蛋白主要在小脑区（CBM）高度表达，包括溴结构域成员和锌指蛋白家族成员。CBM区的核蛋白高表达可能是由于小脑灰质中细胞核增大的高密度神经元所致。
药物靶点的脑区表达差异：将FDA批准的药物靶向的蛋白质列表与蛋白质组学数据相匹配，并确定了470种。其中，68 种蛋白在大脑区域特异性富集。其中包括11个电压门控离子通道蛋白，以及 ITGB3、ANXA2 和 HDAC2。值得注意的是HDAC2，它在小脑区显示出区域富集，同样，膜联蛋白家族成员 ANXA2在皮质白质区（CCw）富集。此外，被归类为药物靶标的3个3 类蛋白在特定区域分布，在基底神经节区ACE、DCC和CHAT高度表达，在中脑区ACE和DDC过度表达。
总结归纳
该研究1）建立了一种microflow LC timsTOF HT系统，可用于大规模、深度分析蛋白质组，通过优化样品制备、色谱、离子源和MS仪器参数，确定了该系统灵敏、稳健、快速的特性。2）开发了一种从FFPE组织中提取蛋白的高效方法，这为分析人类生物样本库中数百万存档组织样本提供了巨大潜力。3）对13个脑区的分析揭示了独特的蛋白质组特征，识别了一些已知的特定脑区标志物和许多新候选物，发现mRNA与蛋白质水平存在显著差异，强调了直接测量蛋白水平的重要性。
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