方群组、易算：单细胞蛋白质组实现 3000+PG/单个细胞超高深度定量

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    单细胞蛋白质组学因其对样品制备、多肽分离、质谱仪器和工作流程的稳健性和灵敏度方面的超高要求，是衡量质谱实验室技术水平和财力的试金石。今天我们为您带来国内外相关技术的最新进展。相信单细胞蛋白质组学走入寻常实验室就在不远的将来。

方群课题组、易算合作单细胞定量实现3000+Protein Group/单细胞

    为了让单细胞蛋白定量成为一个一体化可复制、迁移的完整流程，方教授组开发了包括全自动化的单细胞识别、分离、多肽提取及上样的高自动化流程，再进一步联用timsTOF Pro的DIA-PASEF定量后，能够实现大量单细胞蛋白质组定量检测。其中的单细胞分离和处理工作站基于方教授组此前开发的sequential operation droplet array (SODA) 技术进一步优化改进而来。其采用细胞悬液成像后识别细胞位置，采用毛细管自动移位并吸取细胞分离，分离成功率大于95%。为了尽可能减少样品转移损失，该工作站直接将细胞转移入色谱进样瓶，并在进样瓶中插入尖底微量反应管后原位裂解、还原及酶切，反应过程中为了降低试剂挥发，采用在反应体系环境内加水保持100%湿度后密封来精确控制反应液体的挥发速度。并最终在400nL的反应体系中得到了最佳结果。

图1. PiSPA平台示意图及单细胞蛋白质组分析整体流程

极高灵敏度单细胞蛋白质组

    采用PiSPA方法，我们在多种细胞中实现了超高深度定量检测。在A549 (n = 37), HeLa(n = 44) 和U2OS (n = 27)细胞中分别实现了1804-3349, 1778-3049和 1074-2487 protein group的定量深度（无缺失值填充）。

图2. 整体定量结果分布。A.分别采用DDA, DIA, DIA+MBR后的蛋白定量分布。B.DIA unique定量蛋白分布。C，分别检测1、5、10个细胞的定量结果。D，DIA和DDA的定量PCA分布。

梯度稀释和细胞划痕实验测试

    在1、5、10个细胞的定量检测时，我们观察到timsTOF Pro在单细胞水平的信号线性程度理想，但略差于timsTOF SCP（图2C，图7C）。

为了进一步验证PiSPA方法的实用价值，我们对Hela细胞培养体系进行划痕实验测试，分别吸取有明显迁移和未发生迁移的Hela单细胞进行差异定量分析。2类细胞的PCA分类差异明显，并在分析得到的差异蛋白中有相当一部分蛋白被已有文献证明和细胞迁移密切相关。

图3 单细胞迁移实验结果

    在后续的应用测试中，方教授课题组已与合作者利用PiSPA平台进一步分析多种类型实际临床样品，扩大其应用范围。后续会继续与易算合作结合EvoSep、Aurora技术和最新数据分析技术，进一步提升单细胞蛋白质组的检测深度，同时推出完整的商品化解决方案，敬请期待。

    另外我们也为您带来IonOpticks和EvoSep联手推出的最新货架式方案。基于Aurora3代色谱柱的Whisper方法最新结果，能够快速部署于timsTOF SCP，实现高深度覆盖。

图4 基本分析流程

实验方法

    采用Pierce的HeLa胰蛋白酶消化液，梯度稀释后分别加到Evotip Pure上0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16和32ng。另取HeLa细胞，采用cellenONE进行分类、收集和消化，收集1、5和10个细胞加载到单独的proteoCHIP孔中。样品采用Aurora Elite色谱柱（15cm，75µm ID，1.7µm填料)下使用EvoSep Whisper 40SPD方法进行分析。联用timsTOF SCP dia-PASEF模式采集。dia-PASEF数据使用DIA-NN 1.8进行分析，使用人swissprot +isoform的library free检索，MBR功能关闭。

色谱性能

   我们首先评估了基于在Evotip Pure上加入5ng HeLa，在dia-PASEF模式下的色谱性能。根据m/z599.75、566.75和663.84(+/-0.02Da)提取离子流，选择3种跨梯度洗脱的诊断肽监测峰性能和保留时间稳定性。亲水肽(m/z 599.75)在4次重复中FWHM为2.5秒，而其他肽m/z 566.75和663.84在4次重复中平均FWHM4秒(图5A)。全新Elite色谱柱使所有鉴定的precursor中位FWHM为3秒，且这些多肽的保留时间相当稳健，10次平行分析的标准偏差为10秒(图5B)。

图5 (A) 5ng Hela的m/z 599.75, 566.75 和663.84色谱Base peak及XIC图。(B) 10针重复的保留时间重复性

梯度稀释测试

    我

们通过对六聚酸盐(Pierce)中的HeLa酶切肽梯度稀释，从最低上样量62.5pg到32ng评估了该方案的敏感性。从与单细胞水平相对应的250pg负载中，我们鉴定了超过7000个母离子，导致近2000个蛋白质，而32ng的高负载导致接近60000个肽，导致近7500个蛋白质(图6A和B)。梯度稀释的6次重复结果显示了良好的线性鉴定和定量重复性。极低上样量的结果仍然显示出稳健的识别率，其中500pg负荷达到每分钟识别500个母离子(图6C)。

图6: 梯度上样的(A) 母离子和(B)蛋白鉴定数量。(C) 不同上样量的每分钟鉴定成功的母离子数量

极高灵敏度单细胞蛋白质组

    为了进一步挑战实际样品，我们分析了单个HeLa细胞，分别分离出1、5或10个细胞进行平行裂解和消化。实际测试6个单独的单细胞，以及5个和10个细胞的四次重复实验。其中，单细胞蛋白质组显示出良好的覆盖范围，平均每个细胞鉴定出7800个母离子，对应于2000个蛋白质，除了实验本身误差外，结果的波动可能归因于细胞周期和其他功能细胞状态的生物变异(图7A和7B)。从5个和10个细胞中，使用Whisper设置检测到了超过3300个和5000个蛋白质的深层蛋白质组(图7C)。当将从单细胞获得的蛋白质组深度与HeLa参考稀释系列进行比较时，我们发现从实际单细胞获得的蛋白质组覆盖率与250pg HeLa消化获得的深度相匹配。

图7: 单细胞定量的(A)母离子(B)蛋白水平检测结果。(C) 1、5和10个细胞的定量结果。

结语

    在timsTOF Pro和SCP平台上，我们近期都实现了2000-3000种蛋白质单细胞定量结果，相对于原有1000个左右定量结果的大幅提升。而与此同时，我们的解决方案，无论是EvoSep、Aurora3、PiSPA平台还是timsTOF系列质谱均已经或即将面向用户推出商品化产品。希望在不远的将来，单细胞蛋白质组不再是令人望而却步、高不可攀的技术。