易算整理 | PQ500绝对定量如何计算【初探版】

来自结直肠癌(CRC)队列的20个患者血浆样本，10VS10的样本分组设计。用胰蛋白酶消化血浆样品并加入 PQ500 同位素标记的合成肽。数据由 Skyline 处理。覆盖579种（文章提到,实际不止）血浆蛋白的同位素标记标准品即PQ500，使用prm-PASEF成功定量了血浆中的565种蛋白，其中最低丰度蛋白的定量达到 7 amol。dia-PASEF 能够定量549种蛋白。

这篇文章强调了DIA工作流程在定量精度方面能够与PRM媲美。通过比较DIA和PRM检测到的蛋白数量，证明了DIA具备与PRM相当的性能。此外，研究中使用了PQ500参考标准来实现绝对定量，可以在动态范围高达四个数量级的情况下定量血浆样本中的782种肽段。相比两种方案，DIA实验由于能够提供与PRM相似的蛋白质覆盖率和精确度，具有显著的应用前景。

该数据文章里面用了免费软件skyline解析。方便说明我就直接用了他们的解析结果。矩阵有两个，分别是DIA和PRM的PQ500的矩阵。你会发现也会存在NA和0，这些都算作缺失。其中，DIA被PQ500试剂盒检出744行，PRM被试剂盒检出了782行，分别代表这20例血浆样本鉴定到的肽的数量。

具体查看每个表格的表头，除了样本信息以外，DIA和PRM的数据均为100分钟的运行时间，另外还包含“ratio to standard”和“DotProduct light to heavy”两个指标，这些指标是使用免费软件Skyline导出的，'ratio to standard'表示测到的肽段与参考标准的信号强度比，这样可以帮助判断样品中目标肽段的相对含量；而'DotProduct light to heavy'则表示轻同位素和重同位素标记肽段的匹配程度，用于评估测量的准确性，越接近1越理想。

文章里面至少体现了2处，分别是丰度曲线和表达的盒型图。

丰度曲线：不仅在曲线上标了肽段，还有其具体的浓度定量，因此对到底覆盖了多少具体的数量级可以有更细节的理解。

盒型图展示了CRC 患者与对照组患者之间 蛋白质的方框图。在 PQ500 中，每个蛋白的肽段数量各不相同，肽段数量在 1 到 3 个肽段之间。每个方框图显示了每个肽段的定量分布。橙色为 CRC 患者，深蓝色为对照组。这些都是差异统计的结果。

三、绝对定量怎么算

以文章中提到的CD99这条肽为例。取20 µL的人血浆样品，到算出来这个绝对定量的amol具体的值

1.样品处理：去除高丰度蛋白

2.添加PQ500参考肽段：向样品中添加已知浓度的稳定同位素标记肽段。

3.LC-MS数据采集：质谱检测肽段。

4.数据处理与绝对定量计算：利用“Ratio To Standard”值计算内源性肽段的绝对含量。

下面详细说明。

1.样品处理：去除高丰度蛋白

起始样品是20 µL人血浆，使用Agilent的14种高丰度蛋白去除以及其他前处理步骤，获得洁净的肽段，然后肽段重溶和浓度标准化。

2.添加PQ500参考肽段

2.1 PQ500参考肽段混合物的制备

1.向PQ500小瓶中加入20 µL溶解缓冲液（Dissolution Buffer）。

2.轻轻涡旋混匀，可选用超声浴超声5分钟。

3.加入100 µL的LC溶液（LC Solution），充分混匀。

2.2 向样品中添加PQ500

每个样品操作：取12 µL重溶的肽段溶液，加入LC-MS样品瓶。加入4 µL PQ500参考肽段混合物。做混匀，准备进行LC-MS分析。

3.LC-MS数据采集

略

4.数据处理与绝对定量计算

使用Skyline软件处理LC-MS数据。

提取每个肽段的信号，获得以下两个关键指标：“Ratio To Standard”值（R）：内源性肽段信号强度与标记肽段信号强度的比值。“DotProduct Light To Heavy”值：内源性肽段与标记肽段的碎片离子谱图相似度，值接近1表示谱图匹配良好。对于CD99肽段“NANAEPAVQR”，得到以下定量结果：

样本1：

Ratio To Standard（R₁）：0.0024

DotProduct Light To Heavy：0.987

内源性肽段的绝对定量值（C₁）：7.41 amol

样本2：

Ratio To Standard（R₂）：0.0148

DotProduct Light To Heavy：0.981

内源性肽段的绝对定量值（C₂）：45.45 amol

由于文章中未提供PQ500参考肽段中CD99肽段的实际浓度，我们通过已知的“Ratio To Standard”值和内源性肽段的绝对定量值，反推出重标记肽段的添加量（S）和参考肽段的浓度。

分析绝对定量需要三个步骤

已知参数：

添加的PQ500参考肽段体积（V_pq500）：4 µL

内源性肽段的绝对定量值（C₁和C₂）

“Ratio To Standard”值（R₁和R₂）

步骤1：计算重标记肽段的添加量（S）：利用已知的“Ratio To Standard”（R）值和内源性肽段的绝对定量值（C），反推出S：S=C/R

对于感兴趣的这个肽，

样本1: S= 7.41 amol /0.0024=3,087.5 amol

样本2: S=45.45 amol/0.0148=3,072.97 amol

你看二者算下来非常非常接近了，平均重标记肽段添加量（S_avg）：3,080.24 amol

步骤2：计算PQ500参考肽段的浓度：

• 已知添加体积（V_pq500）：4 µL

• 计算PQ500参考肽段的浓度（C_pq500）：S_avg/V_pq500 = 0.77006 fmol/µL（这个实际操作中，要跟开PQ500壳子的人，以及做实验的人一起配合，得知道壳子原始浓度，实验人怎么加的，浓度到底是多少）

步骤3：确认内源性肽段的绝对定量值

• 使用计算得到的C_pq500，再次计算内源性肽段量。

  即样本1=0.0024×(0.77006 fmol/µL×4 µL)=7.3926 amol；样本2 = 0.0148×(0.77006 fmol/µL×4 µL)=45.586 amol

绝对定量的结果出来以后，就可以差异分析、功能分析等。这篇文章在分析 prm-PASEF 数据时，只纳入了在所有样本中都检测到的肽。在所有样本中检测到的 288 个蛋白中，有 16 个蛋白在 CRC 患者和对照组之间发生了显著调控。

这一篇比较有代表性。

文献2：Alterations in plasma proteome during acute COVID-19 and recovery

文献链接：https://doi.org/10.1186/s10020-024-00898-5

方案：132 名 COVID-19 患者的血浆样本，分为D1组即患病期以及D180即随访期。从每个血浆样本取出10微升的样品，然后使用特定的试剂盒来准备这些样品。这个过程包括使用胰蛋白酶对样品进行消化，然后在96孔 C18柱上进行脱盐和干燥。然后将这些样品的浓度调整至0.88微克/微升，再添加 PQ500参考肽混合液。最后，使用 LC-MS/MS分析法进行样本分析。

在 SureQuant模式下使用 PQ500套件的 Xcalibur模板来进行光谱采集，然后使用 SpectroDive11软件来分析采集数据。在定量结果中，在576个蛋白质中鉴定出545个，平均每个样本定量了430个蛋白质，占鉴定蛋白质的76%。总共发现了 167 个在 D1 和 D180 差异表达蛋白：113 个（68%）血浆浓度降低了，54 个（32%）血浆浓度提高。

在对血浆中受调控蛋白质的功能分组和通路注释的研究中，发现在 SARS-CoV-2感染期间，最主要受影响的通路是与免疫系统激活、补体和凝血级联、白细胞介素信号以及血小板激活和聚集有关的通路。

此外还特别收集了患者的心脏参数，以便将血浆蛋白浓度变化与他们的临床特征联系起来。

急性期蛋白（CRP、SAA1 和 SAA2）偏离， COVID-19 六个月后测量的浓度相差 3 到 6 倍。继而文章重点关注了这三种蛋白质，并根据患者的临床状态评估了它们的血浆浓度差异。通过研究不同严重程度的感染症状患者(NIH-2组与 NIH-1组),研究者发现这些蛋白表达水平在感染症状严重的患者中增加或减少的幅度较大。研究还关注了心脏结构和功能的变化，特别是左心室的变化。在有心脏结构和功能变化的患者中，这些蛋白质表达水平与未发生显著变化的患者存在差异。

体现了绝对定量的检测优势。

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