易算解读 | 体液-组织联合分析策略优化大队列生物标志物研究的四种思路
怎么理解？在初始发现阶段，你可能想先理清哪些蛋白既能在组织和血浆中被可靠定量，又在这两个层面上呈现出某种特征性的差异。你可以挑选出在组织与血浆中都有定量数据的蛋白，然后运用统计方法（如Pearson相关分析）对同一患者的组织-血浆配对数据进行评估。目的是在个体层面明确哪些蛋白在两种类型的样本中同步变化。
案例：肝脏和血浆样本的蛋白组学结合机器学习筛选酒精性肝病生物标志物
首先从定量结果中选取在肝组织与血浆中均能被定量的蛋白（此例约420个），并将它们在两种类型样本中的相对丰度排序映射到二维坐标系中。
到了二维坐标以后文章提到两个簇：A）对角簇（Diagonal cluster）：这些蛋白在肝脏内的相对丰度基本能在血浆中得到反映（一致性高）。注释后发现有经典的分泌蛋白或高丰度血浆蛋白，提示这些蛋白的血浆水平可能直接受到肝脏合成与分泌功能的主导。B）垂直簇（Vertical cluster）：这类蛋白在肝与血浆中无显著丰度排序关联。文章重点关注A对角簇的分子。
接下来，通过统计学相关分析（如Pearson相关）对配对样本（同一患者的肝与血浆数据）识别哪些蛋白在个体层面上呈显著正相关（例如，C7、IgA1和CRP在肝与血浆中的丰度显著相关），暗示这些蛋白在血浆水平的变化可部分反映肝脏状态。
基于组织学分级（如纤维化F0-F4），识别那些在疾病进展过程中在肝与血浆中同步显著变化（“codysregulated”）的蛋白。这些蛋白往往涉及免疫炎症反应、细胞外基质重塑与组织损伤。这类蛋白从早期阶段就开始出现同步转变，做早期无创诊断提供标志物候选。
因此，假如你有组织和血浆，而且结合病理分期或者疾病的严重程度来分组，你发现某些蛋白在肝组织中表达量增加，而在相应的血浆样本中也有类似上升趋势，那么这些蛋白可以进一步聚焦。
方案二：以差异蛋白并集为标志物库，开展靶向验证与建模
一旦你在第一步中找到一些值得深究的目标蛋白，不要就此止步，而是要进一步打造一个专门的“标志物库”。可以把它看成你未来深入研究的“工具箱”——里面收集了潜在的候选蛋白。继而你可以针对这些蛋白进行更为精确的靶向分析（例如PRM定量）。与此同时，通过统计建模或机器学习方法（如LASSO回归或逻辑回归）为你的标志物组合“瘦身”和“提纯”，直到标志物模型的特异性、敏感度和稳定性都达到理想状态。
案例：基于质谱蛋白质组学找到“颅内动脉瘤”（IA）的血清蛋白标志物
如何在血清中找到蛋白标志物？这项研究分四步。
第一步：构建标志物库。不仅根据目前组织和血清蛋白质组分析中发现改变的蛋白，还加上既往文献研究，组建了一个广泛的候选生物标志物库（SPCBB）-包括多达717种蛋白，使目标标志物验证工作更加灵活和全面；
这个标志物库是这样构建的：来自IA组织及IA血清样本的蛋白质组分析，共计860个差异蛋白。对英文文献与综述进行系统检索，获得446个已报道与IA相关的基因或蛋白。将上述数据整合、去冗余并结合细胞成分和信号肽预测信息，最终获得717个潜在血清标志物纳入SPCBB。
这些蛋白质在血清目标蛋白组分析中得到进一步验证。
第二步：借助深度学习工具DeepPRM对SPCBB中的候选肽段进行预筛，有效提高了质谱PRM检测的成功率；第三步：验证肽段。血清组人群1(n=212)和Ⅱ(n=32)被进一步定量分析其潜在标志物；第四步：机器学习。机器学习建立两套生物标志物组合(P6和P8)，在外部验证集(n=32)的评估中准确区分IA与健康对照(准确率:87.50%)或对 IA破裂患者进行分类(准确率:91.67%)。
通过上述流程，标志物库的作用得到了充分体现：从最初的广泛候选集，到精确定量与数据驱动的模型筛选，再到外部独立人群验证，标志物库确保所获得的标志物组合更具转化潜力和临床应用价值。
方案三：跨组学融合与多层级验证
如果有条件，不妨跳出单一组学的限制。
比如，有人在血浆中用蛋白质组学方法圈定了候选标志物，但在组织层面却采用了转录组学进行深挖，将二者结合不仅能从多个角度阐释潜在机制，还能提升标志物的可靠性。如果想进一步明确这些蛋白在组织中的“出处”，你还可以借助独立的公共单细胞RNA测序数据来确定它们的细胞类型来源。
当然，这一切最终还要回归临床场景检验。你可能选择一批独立的血清样本进行外部验证，看这些标志物在另一个独立人群中是否仍然有效。再者，通过组织学层面的免疫组化分析，可以直观观察标志物在不同病理阶段肝组织中的分布和动态变化。
案例：蛋白-转录组联合分析揭示非酒精性脂肪肝病分子特征图谱
研究在191例经组织学表征的NAFLD患者中进行血浆蛋白组分析，其中52例患者有配对的肝脏活检组织。接下来通过皮尔森相关分析，将血浆中4730种循环蛋白的表达量与同一患者的肝脏转录组（RNA-seq数据）进行关联分析，从中筛选出与肝脏转录特征显著相关的蛋白标志物。
获取31个既与纤维化进展（F3-4）又与较高疾病活动度（NAS≥4）相关的显著蛋白-转录分子（见下图a）。接下来利用独立的公共单细胞RNA测序数据集（并非本研究患者来源的数据）(见下图b)，以此确认这些蛋白主要由何种肝脏细胞类型产生（例如肝细胞、胆管细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等）。
在发现队列上将特定循环蛋白（如ADAMTSL2、AKR1B10、CFHR4和TREM2）和临床因素（如BMI、2型糖尿病状态）纳入逻辑回归模型，然后使用115例独立的血清样本对上述逻辑回归模型进行验证，评估模型的诊断性能与泛化性（此处使用血清而非血浆，因此结果对比时需慎重理解两种样本类型之间的潜在差异）。
最后是组织学水平验证：在30份独立的肝脏石蜡切片上进行免疫组化分析（如AKR1B10的免疫染色）以证实该标志物在不同疾病阶段的肝组织中分布情况，从而进一步明确这些体液标志物与肝组织内病理变化和组织来源的关联。这样，通过多层级其研究成果将从数据推论渐渐走向临床现实。
方案四：多样本类型与多维度整合
最后，如果你有充足的样本和资源，那就不妨进一步扩展实验的维度。在血浆与组织之外，纳入尿液、外泌体等不同类型的样本，并结合多平台质谱技术与数据分析方法，从多个维度构建更完善的标志物图谱。多类型的综合策略能捕捉疾病在不同生物学介质中的特异信号，还可以交叉验证与数据互补。
案例：血浆蛋白质组分析发现与上尿路尿路上皮癌相关的分子特征
总体思路
将多种生物样本（血浆、组织、尿液、血浆外泌体）进行蛋白质组学分析，通过与健康对照以及不同病理分期样本的比较，利用统计和机器学习方法对差异蛋白进行筛选和模型构建，并在独立验证队列和PRM定量分析中进一步验证标志物与模型的稳定性和实用性。
样本类型
1）血浆样本（核心样本类型）：来自UTUC患者和健康对照的血浆，用于大规模DIA定量蛋白组学分析。2）肿瘤组织与正常组织样本：对部分UTUC患者提供配对的肿瘤组织与正常上皮组织，通过DDA（Data-Dependent Acquisition）蛋白组学技术定量分析，用于与血浆中差异蛋白进行交叉验证，提高标志物的特异性与可信度。3）尿液样本：少量UTUC患者与健康对照的尿液样本，尿液与泌尿系统肿瘤接触最直接，有可能出现更多与肿瘤局部病变相关的标志物。4）血浆外泌体（EV）样本：从UTUC患者和健康对照血浆中分离外泌体的蛋白组学分析，可能富集肿瘤特异信息，可与整体血浆数据互补。
在针对上尿路尿路上皮癌（UTUC）的研究中，研究人员可对血浆、组织、尿液及血浆外泌体样本进行多平台蛋白质组学分析，与正常对照及不同病理分期的样本进行比较，从而识别多个生物来源中共同且具代表性的差异蛋白。随后利用Logistic回归、LASSO、Stepwise回归等统计模型和机器学习方法，从中优选出诊断、分期预测及预后预测价值更高的标志物组合（protein panel）。
通过在独立验证队列中使用PRM等靶向定量技术对筛选出的蛋白面板进行检验，可进一步确认标志物组合的稳健性与临床应用。最终获得一系列能区分UTUC患者与健康对照、以及区分非肌层浸润型（NMI-UTUC）与肌层浸润型（MI-UTUC）的标志物，建立由多个蛋白构成的“进展时钟”用于预测患者的无进展生存期。
通过上述四种策略，你可以为自己的研究找到最适宜的路径。无论你是刚开始探索，还是已经有了初步线索，这些策略都能为你提供参考，让你的研究设计更有的放矢。欢迎继续讨论。
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