易算解读 | 循环蛋白质组学——技术进展、当前挑战与未来趋势

你好，我是易算生物的玲姐。

今天我带来一篇文献解读。不算翻译，是我带着自己关心的问题从文章中提炼答案。

循环蛋白质组学研究的对象是血浆和血清中的所有可能存在的蛋白质，其丰度跨度超过12个数量级，从高丰度的白蛋白、免疫球蛋白到低丰度的细胞因子和生长因子。这种巨大的浓度差距对低丰度蛋白检测提出挑战。

上个月，我读到国家蛋白质中心-北京（凤凰中心）的于晓波研究员、德国马克斯普朗研究所的Philipp E. Geyer教授等多位国际领军学者发表了一篇名为The Circulating Proteome ─ Technological Developments, Current Challenges, and Future Trends的文章，刊登于J Proteome Res期刊。这篇文章阐述了2024年国际人类血浆蛋白质组项目（HPPP）的最新成果。

对于玲姐来说，主要关心本文的以下内容：

• 为了提高低丰度蛋白的检测数量，有哪几种方案？

• 对于血清或者血浆的质谱蛋白组来说，除了要考虑质谱仪的选择、样本前处理、自动化处理工作站来，还要考虑什么环节来提高蛋白的鉴定？

• 细胞外囊泡（EVs）在循环蛋白质组中的作用是什么？如何实现以及可以讲什么故事？

• 微量采样技术逐渐得到关注。这种技术怎么实现以及可以讲什么故事？

• 从这篇文章的角度，循环蛋白组数据分析要强调什么？

  
  

  
  

1.1 基于亲和力的分析平台

利用亲和力方法可以将蛋白质组研究锁定在一组预定义的目标蛋白内。文章提到有近500万种亲和试剂可供选择，涵盖约95%的蛋白质编码基因。包括但是不限于可以通过使用Olink的邻位延伸测定（PEA）和SomaLogic的核酸适配体（SOMAmers），分别可以检测超过5,400和11,000种蛋白质。这些方法的应用显著提高了低丰度蛋白灵敏度。想达到这个数量级别价格肯定是很美丽的。

1.2 质谱技术的进步

传统质谱技术在高丰度蛋白质的干扰下，难以检测低丰度蛋白，但是随着质谱仪本身的稳健性和持续的高性能在过去几年中得到了大幅提升。除了布鲁克 timsTOF HT 系列在多项大规模血浆蛋白质组学研究中的表现很好以外，新型质谱仪如Astral的推出也显著提升了蛋白质组的覆盖率。例如文章提到结合富集策略，在分析中检测超过4,000种蛋白。同时，数据独立采集（DIA）技术的应用使得可定量更多的蛋白质，进一步增强了低丰度蛋白的检测能力。然而，仅依靠新仪器和技术并不足以解决所有问题，样本处理的一致性也需考虑。

1.3 -1.6 其他

高丰度蛋白耗竭:利用商业化解决方案，通过结合在固相色谱基质上的抗体，可以耗竭样本中丰度比较大的蛋白。

细胞外囊泡分析: 研究细胞外囊泡（EVs）EVs可以携带在血浆中不易检测的蛋白，其浓度较低。采用专门的技术来分离和分析EVs，能够发现这些蛋白。

磁性功能化纳米粒子（NPs）技术:通过竞争性结合的方式，可以在数小时内检测数千种循环蛋白质，并有潜力扩展到成千上万的样本。这种方法不需要预先选择感兴趣的蛋白质，能够全面探测整个蛋白质组，通常是由商业供应商推动的。

来自结直肠癌(CRC)队列的20个患者血浆样本，10VS10的样本分组设计。用胰蛋白酶消化血浆样品并加入 PQ500 同位素标记的合成肽。数据由 Skyline 处理。覆盖579种（文章提到,实际不止）血浆蛋白的同位素标记标准品即PQ500，使用prm-PASEF成功定量了血浆中的565种蛋白，其中最低丰度蛋白的定量达到 7 amol。dia-PASEF 能够定量549种蛋白。

文献b链接：https://doi.org/10.1186/s10020-024-00898-5

方案：132 名 COVID-19 患者的血浆样本，分为D1组即患病期以及D180即随访期。从每个血浆样本取出10微升的样品，使用胰蛋白酶对样品进行消化，然后在96孔 C18柱上进行脱盐和干燥。然后将这些样品的浓度调整至0.88微克/微升，再添加 PQ500参考肽混合液。最后，使用 LC-MS/MS分析法进行样本分析。

在 SureQuant模式下使用 PQ500套件的 Xcalibur模板来进行光谱采集，然后使用 SpectroDive11软件来分析采集数据。在定量结果中，在576个蛋白质中鉴定出545个，平均每个样本定量了430个蛋白质，占鉴定蛋白质的76%。总共发现了 167 个在 D1 和 D180 差异表达蛋白：113 个（68%）血浆浓度降低了，54 个（32%）血浆浓度提高。

此外，新型混合高速 Stellar MS 的开发正朝着未来临床应用的方向快速发展。Stellar MS 具有很高的重现性、灵敏度和特异性，足以检测 1000 多种血浆蛋白，并已应用于酒精相关肝病生物标志物的靶向检测。

此外，软件的进步SpectroDive™12：带着AI和超多实用功能强势来袭！，尤其是智能采集方法的应用（如SureQuant、TOMAHAQ等），进一步提高了靶向质谱易用性。这些策略提高了质谱采集数据时加标SIS目标肽的重视程度。

三、细胞外囊泡的作用以及检测可以讲的故事

EVs可成为潜在的生物标志物和药物递送载体。

细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌的一类异质性脂质双层颗粒，在细胞间通信和物质运输中发挥重要作用。EVs内含有多种生物分子，如微RNA、mRNA、脂质和蛋白质，这些成分可以转移到目标细胞。

在研究血浆中的EV（pEVs）时的挑战包括颗粒的异质性、低丰度，以及与血浆中高丰度非EV复合物（如低密度脂蛋白和乳糜微粒）的物理化学相似性，这导致在EV分离过程中容易发生共同富集。此外，从pEVs的质谱分析中识别的蛋白数量通常远低于从细胞培养中分离的EVs。

为从血浆中富集EVs，已开发出几种技术，最常用的包括超离心、尺寸排阻和免疫捕获等。这些技术各有优缺点，但都面临特异性、可扩展性和可重复性等独特挑战。有人引入的强阴离子交换（SAX）磁珠已被用于结合磷脂双层颗粒。将蛋白聚集捕获（PAC）样本制备与磁性颗粒直接结合，形成了一个自动化的工作流程，能够无缝集成富集和蛋白质组学样本制备。

已有多项研究报告了不同EV亚群的标记物，如外泌体的四跨膜蛋白和Alix，微囊泡的肌动蛋白-4和HSP90B1。国际细胞外囊泡学会（ISEV）早已发布了MISEV指南来提高研究的可重复性和质量。

近年来，许多研究会基于不同表面标记物定义EV的亚群，通常使用免疫捕获与质谱分析的组合识别出1000到2000种蛋白，但通常以较低的通量和较高的起始体积为代价，尽管如此仍然是一个让很多人看到潜力的领域。因为EV的成分因其来源细胞不同而异，反映出其起源细胞的特征。此外，EVs提供了更接近细胞的动态蛋白质浓度范围，成为潜在的生物标志物和药物递送载体。

优点是快速临床转化。

研究微采样的原因在于，它可以满足个体临床测试的需求，同时为成本效益高的离线健康监测提供了新方法。理想的采样方式应该是快速、稳定，并尽量减少临床人员的介入，还能存储丰富的生物分子信息，反映健康和疾病状态。微采样技术能够收集极小的样本量（例如血滴或间质液），这使得它重新受到关注，因为这些样本能提供蛋白质、代谢物和脂质等重要的生物信息。

微采样有很多优势，比如不需要专业的抽血师或医生，这样就能更灵活地进行反复的纵向采样，有助于深入理解疾病的不同表现。以患者为中心的采样方法也使得大规模健康评估成为可能，并能够在运动或药物试验期间进行高频率的样本采集，从而捕捉到分子变化。

近年来，体积微采样设备作为传统干血点（DBS）采样的替代方案，能够以精准的体积（如10、20或30 μL）收集样本。

使用微采样设备收集的样本在进行深度蛋白组学分析时面临一些挑战。例如，血液中大量的红细胞会掩盖目标分析物，从而限制可检测的动态范围。此外，干燥的蛋白质可能形成难以解析的盐晶，而从这些基质中洗脱蛋白质时可能需要使用洗涤剂或化学处理，这可能影响样本在蛋白组学分析中的适用性。最后，样本的异质性（包括可溶性蛋白、囊泡和细胞）也要求我们调整蛋白提取的流程，以确保结果的准确性。

但是，一旦人群上了规模，这块市场还是很大。

循环蛋白的网络分析可以形成机制上的假设。例如器官或组织渗漏、循环细胞的存在、稳定的蛋白质复合物、脂蛋白颗粒的聚集，以及对特定刺激的反应都可以通过网络分析来推动。

通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），构建出包含499,500个相关性的矩阵，并通过聚类分析提取功能关联。这种方法在大规模样本中尤为重要，例如，研究5000名冰岛人的血清样本时，发现了与健康结果相关的蛋白质调控网络。

尽管相关性不能证明因果关系，但与临床参数或生理测量的关联可以生成关于潜在生物机制的假设。结合GO或KEGG术语进行的富集分析能够进一步揭示相关集群的生物学线索。这些网络分析为我们提供了生物标志物与临床变量之间的联系，生成关于生物机制的假设，进而推动相关疾病的早期诊断与治疗。

最后：在未来的研究中，我们期待看到更多创新的技术和方法，以及这些研究如何转化为实际的临床应用。谢谢大家的关注，期待与大家共同探讨更多有趣的话题！