案例课堂：磷酸化蛋白质组生信个性化分析

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本篇的磷酸化分析要点：

1. 快速找到关键的磷酸化调控通路和核心调控因子，以选择更有意义的生物标志物；

2. 与常规分析发现的蛋白水平变化的调控因子不同，IPA可基于数据库中已有的磷酸化文献信息推断磷酸化变化的调控因子

3. 基于多时间点（剂量、分组）的比较，可以看到磷酸化调控的相关通路激活趋势特征；

范例文献

volume 14, Article number: 94 (2023)

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实验设计

范例数据：TNF-α刺激15分钟的人MCF-7细胞磷酸化蛋白质组，DIA-PASEF定量。

范例设计

研究者利用TNF-α诱导的磷酸化蛋白质组学实验，评估了Spectronaut在细胞信号传导研究中的分析性能。其中MCF-7细胞在不存在或存在核因子kappa-B激酶抑制剂（TPCA-1）的情况下用TNF-α刺激。换一句话说，MCF-7细胞被单独处理（用DMSO/TNF-α处理10分钟），或联合处理（TPCA-1先处理20分钟，然后TNF-α10分钟）。

借鉴意义

药物（TPCA-1刺激）对疾病进程（TNF-α处理）的抑制机制的范例

对TPCA-1有反应的磷酸化： 那些被TNF-α上调并被TPCA-1处理抑制的位点. TPCA-1一般用来阻断TNF诱导的促炎途径。

处理步骤

采用Spectronaut17，directDIA+分析DMSOvsTNF（及加入TPCA1抑制剂处理的细胞）处理的MCF-7细胞定量数据，采用默认BGS Phospho PTM Workflow分析模板和默认差异统计方式导出PTM差异定量结果。

数据列表

分析参数

Candidates栏中筛选修饰phospho，去除AVG log2 Ratio和Qvalue的默认0.58及0.05的卡值，输出所有蛋白差异比较列表。默认PTM Workflow仅输出高可信位点prob>0.75信息。

结果输出

输出表格中将ProteinGroups的ID移到第一列，将位点信息分列删除后仅保留修饰位点值，如下图，后续分析仅需要A,B,D,G四列信息，其他均无所谓：

表格范例

注：Site信息仅用于可视化标注和对应文献筛选解读，不同site的功能差异需要额外分析。

数据分析

本次结果TNF组共得到8837个可靠定量磷酸化位点，其中1.5倍差异、统计检验<0.05的共940个，对应差异蛋白质689个（340个下调，349个上调）。TPCA1组共8558个位点，差异蛋白688个，下调459，上调229个。个性化分析采用IPA软件。

注：作为实验主要变量TNF本身因不是磷酸化蛋白而未被检测到。

结果

1. 结果整体展示

2. 上游激酶或其他调控因子预测

3. 磷酸化调控的关键信号通路

4. TPCA抑制剂加入与否趋势比较

5. 磷酸化与蛋白组数据联合分析的必要性

TNF+TPCA1-结果整体网络

上图是TNF vs DMSO差异磷酸化定量分析的总体网络。成功的预测TNF、MAPK9是该实验数据的核心调控因子，并且调控了TNFR1,2等信号通路。而表型层面的肿瘤生长和细胞死亡均收到相关磷酸化变化的促进。

TNF+TPCA1+结果整体网络

而TPCA1组的TNF信号通路则受到显著抑制而不再相关。

差异磷酸化蛋白的可能上游调控因子预测也是磷酸化数据分析中非常重要的指标信息。

显著调控上游因子

TNF组的调控因子预测分析可以帮助我们分析差异磷酸化变化的主要诱因，可以看到上图中包含了大量MAPK,ERK家族蛋白以及TNF蛋白本身。

TNF调控网络

相关的数据库注释结果也佐证了我们的发现并且协助我们寻找更多的关联。

信号通路富集气泡图

纵坐标表示磷酸化调控相关通路，横坐标表示富集分析显著性水平−log（P value），气泡的橙色正向调控，蓝色负向调控，图中气泡越大，越多位点与该通路相关

信号通路富集条形图

纵轴列出磷酸化调控相关通路，横轴表示富集分析显著性水平−log（P value），橙色正向调控，蓝色负向调控

TNFR2信号通路

TNFR1信号通路

我们可以非常直观的看到TNF调控信号通路的显著富集，尤其是TNFR1 TNFR2 OX40等关键信号通路的调控关系，以及下游转录因子如c-JUN，NFkB等的调控途径。

该分析不仅使用户能够发现在疾病中可能被改变的通路，而且可以看到通路的趋势变化或不同处理下的显著差异。

在我们继续加入TPCA的数据分析结果后可以分析抑制剂加入的影响。

TPCA1-和TPCA1+结果对比

上图从左到右依次对比了TNF（热图左列）和TPCA1处理（热图右列）的信号通路、上游调控因子和功能疾病富集结果的趋势差异。橙色为激活、蓝色为抑制，颜色越深表明该趋势越显著。可以发现加入TPCA1后的相关结果发生了大幅反转，那些被TNF-α上调并被TPCA-1处理抑制的分子和位点，以及相关途径的调节变化，可以帮助理解药物的作用机制。

我们以TNF调控的主要信号通路为例，展示加入TPCA1与否的分子差异,以及与单纯的TNF刺激相比， 药物的加入抑制了基因转录多种下游效应物，进而影响细胞存活、转录和信号传递，见下表格：

TNF+ TPCA1-	TNF+ TPCA1+
TNFR Signaling
MAPK Signaling
NF-kB Signaling
ERBB Signaling
RIG1 Receptor Signaling

很多人纠结于是否要同时采集蛋白质组水平差异数据。假如单纯只检测了磷酸化，在解释结果的时候会有一个问题，即磷酸化的修饰改变，到底是“乘客（蛋白表达量改变造成的结果）”还是“司机（病变的驱动因素）”？

对于瞬时刺激的磷酸化信号通路来说，蛋白水平的变化可以有效提示我们差异究竟是蛋白还是磷酸化水平引起的，如果蛋白水平完全没有变化，更有可能这种磷酸化蛋白质组的差异，是实实在在的修饰变化驱动而不是单纯的蛋白表达量变化驱动的。

我们实际结果存在太多的可能性：

而且这些可能性，可能会出现在同一条通路中。如下图，为TNF刺激后的实验结果：

TNFR1信号通路蛋白质组和磷酸化调控对比

TNFR1信号通路对于TNF刺激后的蛋白质组和磷酸化水平变化差异。上图箭头所指分子旁边的柱形图从左到右分别为蛋白质水平和磷酸化水平差异。

我们可以非常清晰的看到MAP2K4蛋白在蛋白质组水平无任何变化而磷酸化发生上调。RELB则磷酸化水平显著下调。c-JUN这个转录因子的变化则很明显是蛋白表达量的发生了变化，而磷酸化水平很有可能是随之变化而非真正磷酸化上调。

因此，联合蛋白组和磷酸化对我们分辨效应因子及其关键扰动非常有帮助。

此外，TPCA1这个药物的作用机制，本次结果发现是通过抑制JUN,FOS信号来抑制被TNF引发的cell survival。

TNFR1局部对比

尽管在TNF刺激的作用下（左图），NF-κB信号由于RELB磷酸化水平显著下调得到关闭，但是由于旁路激活的作用，JUN,FOS为激活状态，继而仍然存在cell survival的激活。旁路激活是很多药物之所以疗效不佳的机制之一。

加入药物可逆转这个趋势吗？

TPCA1抑制剂的实验结果发现（右图），NF-κB信号仍然关闭，同时JUN,FOS信号也关闭，抑制旁路激活，因此该研究亦可以为耐药株的复敏带来启发。

总结

1、随着关于 LC 和 MS 仪器、计算算法和软件工具中各种基于 DIA 创新的报告的迅速增加，DIA-MS 已发展成为新一代蛋白质组及磷酸化学策略。

2、本文强调了软件Spectronaut和蛋白-磷酸化多组学策略的综合作用，以及基于 IPA 的经典通路分析、功能分析、上游调控分析等，为样本组间变化涉及的分子机制研究提供了初步依据。

3、本分析补充了单组学数据中隐含的知识和规律。