【案例重现】蛋白质组学分析揭秘细胞应对热扰动的秘密 —— PNAS案例研究的深入解读
PNAS项目流程方案介绍
在上一篇推文【】中我们主要分享了研究思路以及研究结果。
该研究设计并制造了一种能够精确附着于细胞膜特定区域（如脂筏和非脂筏区域）的纳米加热器，并发现局部加热能显著改变细胞膜的结构和流动性。特别是关键区域（非脂筏区域）的热扰动显著增强了细胞的迁移能力。
然而这只是故事的开始。
今天，我们将重点介绍这个项目中一个非常重要的环节：蛋白质组学分析（DIA）的应用。研究团队深入研究了加热处理对细胞内蛋白质表达和信号通路的影响。
敲黑板了： 我们的重点不仅仅是介绍技术的基本框架，而是深入解析其产品方案和数据分析流程的细节。通过精细化的数据解读和分析，我们将揭示纳米加热器在细胞膜层面上的作用机制以及它们如何影响细胞功能和迁移。
该项目采用directDIA定量蛋白质组学：
脂筏域处理组（raft, -NIR）：将纳米加热器定位在细胞膜脂筏结构域，但没有近红外（NIR）激光激活。
非脂筏域处理组（nonraft, +NIR）：将纳米加热器定位在细胞膜非脂筏结构域，并有近红外（NIR）激光激活。
对照组（Control）：没有引入任何纳米加热器或激光照射的样本组。
（非脂筏区域流动性较高，参与物质运输、细胞骨架的动态变化；脂筏区域上有细胞表面受体和信号蛋白，涉及细胞粘附、细胞迁移等过程调控）
· 一、产品方案
1. 样本前处理：采用iST样本前处理试剂盒（PreOmics, Germany, 易算代理）对蛋白进行变性、还原烷基化、酶解及肽段除盐等过程。
iST是来自蛋白组学领域大牛Matthias Mann教授课题组的核心技术，可对蛋白样品进行快速前处理，从裂解到除盐2.5小时即可处理完毕，其中手动时间＜1h。
2. 色谱分离：采用IonOpticks nano LC 反相色谱分析柱（易算代理）进行样品分离。
IonOpticks Aurora3系列纳米毛细管色谱柱相比于常规柱最大的两个技术优势是：独特的喷针工艺以及独有的nanoZero技术，为多肽LC-MS分离带来最佳解决方案。
3. 质谱检测：采用 timsTOF Pro 2 质谱仪，设置 diaPASEF 模式进行 directDIA 数据采集。
该仪器由最新一代平行累积连续碎裂技术（PASEF）所驱动，其久经考验的稳健性、高灵敏度以及超快速的MS/MS采集速率，为4D-多组学的应用和发展拓宽了道路。
4. 数据解析： directDIA质谱采集后，采用Spectronaut软件（Biognosys, 易算独家代理）对DIA数据进行分析。
该项目采用Spectronaut17进行搜库，集成了最先进的Pulsar搜索引擎，深度学习加持，实现更深度鉴定和定量。目前该软件已经更新到18版本，性能方面有更优越提升：directDIA+算法显著改善了所有主要DIA兼容仪器的鉴定能力；引入了Linux兼容性以及Linux和Windows云支持功能；实现同步分析和采集，快速获得结果等。
5. 生信分析：采用易算生物生信团队的自建流程。
该项目主成分分析采用R语言stats包函数prcomp()作图，聚类分析通过pheatmap package完成，GO和KEGG分析是基于uniprot中的功能注释，采用fisher’s精确检验进行富集分析，蛋白-蛋白相互作用网络使用STRING分析。
· 二、软件搜库
在Spectronaut中导入质谱directDIA下机原始数据。
分析参数：使用Spectronaut对DIA数据进行蛋白质定性和定量分析，相对其他DIA软件，Spectronaut准确性高、灵敏度高、速度快，极高谱图解析率。该项目默认参数（BGS Factory Settings（default）），首先使用Pulsar专利算法生成高质量的库，设置PSM、Peptide和Protein的三重FDR标准，然后再对样本进行DIA分析，设置如下图中的Precursor、Protein的Qvalue和PEP共五重标准，确保获得结果的高度可靠性。
Spectronaut软件操作界面截图
鉴定结果：基于上述流程方案，采用Spectronaut17软件共鉴定到了7600个Protein Groups，每例样本稳定在7500+个PGs。很激动的是，用最新的Spectronuat18版本搜库，观察到将近8000的蛋白鉴定数量。这一变化反映出Spectronaut18在谱图解析和计算算法方面的改进。这种改进不仅提高了数据的丰富度，也增强了我们对细胞生物学复杂性的理解。
各个样本的蛋白鉴定数量
（蓝色：Spectronaut17版本搜库；橘色：Spectronaut18版本搜库）
除了搜库鉴定，Spectronaut软件还可对项目数据质量可视化查看。下面是软件分析的每个样本蛋白鉴定热图，该项目缺失值较少，组内样本重复性良好，这些除了归功于样本本身以外，整个前处理和质谱流程的重复性以及搜库软件的灵敏度也至关重要。
对于该项目细胞样本的深度蛋白鉴定数量，不仅与前处理试剂盒以及LC-MS设备的性能优势有关，还得益于计算算法和软件工具的功能迅速发展。Spectronaut近年来一直为DIA数据分析提供最标准的解决方案，该项目直接解析样本本身DIA检测数据（directDIA），可以不基于DDA建库便能得到较大量的定量蛋白数。
PCA分析：每个点代表一个样本，相同颜色为同一组样本，该项目组内样本很好的聚集在一起，组间样本很好的分离开，说明分组内样本的重复良好，在分组间的样本差异明显。
火山图：分别显示raft (-NIR)（上） 和non-raft (+NIR) （下）处理后的差异表达蛋白。有趣的是，与对照组相比，两种处理均产生蛋白表达差异，并且non-raft (+NIR) 处理后的差异明显多于raft (-NIR)，有281个上调蛋白和543个下调蛋白（下）。
尽管文章未做详细解释，但不难发现纳米加热器在未激活状态下（raft (-NIR)）也会导致细胞内蛋白表达变化，而在激活非脂筏区域加热之后（non-raft (+NIR) ）造成的蛋白表达变化更明显。
这种蛋白质表达的差异，特别是在non-raft (+NIR)处理后，反映了细胞对外界刺激的响应特征。上调的蛋白可能指示着细胞加强了应激反应机制，而下调的蛋白数量几乎是上调蛋白数量的两倍，这可能意味着细胞在应对刺激带来压力的同时，减弱了某些非关键的功能。
GO功能分析：分别显示raft (-NIR)（上） 和non-raft (+NIR) （下）处理后差异蛋白的功能注释。生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)中均有相关蛋白表达改变，包括细胞过程、含蛋白复合物和分子功能调节因子活性等功能。而且，与上述火山图结果一致，non-raft (+NIR) 处理后的差异蛋白数量明显多于raft (-NIR)处理的细胞。
KEGG通路富集分析：分别显示raft (-NIR)（上） 和non-raft (+NIR) （下）处理后哪些通路受到显著调控，这里特别关注了这些通路如何与细胞迁移中的信号转导相关联。三步走。
第一步--关键通路
这两组均与细胞迁移中的信号传导有关。特别是在raft (−NIR)组，许多信号通路受到调节，包括过氧化物酶体增殖激活受体（PPARs）、肌动蛋白细胞骨架和细胞粘附分子的调控，这些都直接涉及细胞迁移。PPARs是增殖激活受体家族的成员，涉及细胞周期调控、激活后抑制细胞生长及肿瘤发生和发展的其他通路。对于nonraft (+NIR)组，主要受影响的是氧化磷酸化、焦点粘附和细胞外基质（ECM）受体相互作用通路。
第二步--关键分子
易算生信团队进一步深入分析了通路中的关键差异分子。
比如，这三个与PPARs通路相关的差异蛋白：载脂蛋白APOA1（Padj value=0.004，FC=0.146）和APOA2（Padj value=0.013，FC=0.167）在raft(-NIR)组中表达下调，以及血管生成素样蛋白ANGPTL4（Padj value=0.009，FC=3.092）表达上调。
我们还识别出与氧化磷酸化途径相关的多个差异表达蛋白，包括NDUFA4（促进人结直肠癌细胞体外生长）、NDUFB3、NDUFB1、NDUFA3、NDUFB11、MT-CO1、MT-CO2、MT-CO3、MT-ND2、COX6A1、COX4I1、COX7A2L、ATP6V0C和ATP6V0D，这些分子在non-raft (+NIR)组中表达上调，而NDUFA4L2下调表达。
第三步--分子意义
针对上述关键分子的上下调表达现象，易算生物通过分析其分子功能背景，提出了可能的生物学解释。
在raft(-NIR)组中，观察到PPARs通路中一些蛋白质，比如APOA1和APOA2的表达发生变化。推测可能与细胞在该环境下对能量和代谢过程的重新分配有关，以优化资源利用和维持细胞稳定性。
对于non-raft (+NIR)组，氧化磷酸化通路中的多个分子上调表明细胞可能在增强其线粒体功能，以应对增加的能量需求或应激条件。
表达聚类分析：显示了与细胞迁移相关蛋白在不同实验处理条件下的表达模式，结合该蛋白的相关功能背景解释为什么会发生如此表达变化。以CARMIL-2为例，在（raft, -NIR）处理组中其表达量减少，而在（non-raft, +NIR）处理组中增加。这种表达模式的变化可能与细胞膜异质性的改变有关。
CARMIL-2是一种调节细胞骨架重组的重要蛋白，它可以阻断F-肌动蛋白异源二聚体的加帽蛋白活性，从而影响细胞迁移。在（raft, -NIR）处理条件下，CARMIL-2的减少可能反映了细胞对这种刺激的适应性调整，导致细胞骨架的重组和细胞迁移能力的改变。相反，在（non-raft, +NIR）处理条件下，CARMIL-2的增加可能促进了细胞在改变后的膜环境下维持或增强其迁移能力。
以上便是易算生物对该项目提供的蛋白组学产品方案和数据分析流程，揭示了膜特定区域加热对细胞迁移相关的蛋白质和信号通路的影响。
分析彩蛋
我们再回过头来探索本项目的实验数据，发现有很多点可以深挖，比如：MTA3等分子的趋势与CARMIL-2的表达相反，在（raft, -NIR）处理组中其表达量增加，而在（non-raft, +NIR）处理组中减少。与CARMIL-2的表达模式形成了鲜明对比。
这类分子的表达方式可能揭示了它们在细胞膜异质性变化下的不同角色和功能。MTA3（Metastasis-associated protein 3）在核内发挥作用，影响基因表达和细胞分化。其在non-raft(+NIR)条件下的下调可能与改变的膜环境和细胞行为调整有关，如迁移能力的增强。这与文献报道一致，MTA3基因表达水平下调可能促进某些类型癌症细胞的转移（Si, Wenzhe et al. Cancer cell）。
以上观察到的蛋白表达变化表明，膜异质性的改变确实可以调节细胞迁移行为。
关于DIA定量蛋白质组学，从1）自动化高通量的前处理方案、2）高效稳定的色谱分离体系、3）DIA数据处理商业分析软件、数据质控和4）生信分析平台，易算有一套完整的产品工具箱。有哪些关键步骤呢？
第一步是自动化前处理，确保你的样本不浪费，同时也是鉴定深度和稳定性的前提；
第二步是数据的获得，以及为数据的可靠性保驾护航，尤其针对大队列样本，Spectronaut可实现超过1000个DIA原始文件同时分析；
第三步是数据的解析，帮你抓住关键线索，易算生物生信团队定制化的分析流程和分子功能背景知识库，助您发掘关键标志物或解释生物学机理。
今天的内容就到这里。我也要拜托你一件事，如果你在跟随我们案例的过程中，有疑问，请一定留言给我，我来为你做进一步的解释，我想和你共同探讨，解决问题。如果你也想尝试蛋白组研究的产品，或者想合作挖掘临床组学数据，欢迎致电或留言。
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