灵敏度提高10倍| Matthias Mann 新流程助力单细胞蛋白质组获得对健康和疾病中细胞异质性的前所未有的洞察力
文章：Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation
链接：Mol Syst Biol. 2022 Mar;18(3):e10798. doi: 10.15252/msb.202110798.
作者：Matthias Mann实验室
价值：单细胞蛋白组流程迭代，让大规模临床样本的研究有更多选择
蛋白质是绝大多数药物的作用靶点。临床样本的特点是个体差异大而且样本微量，因此临床蛋白质组学技术将继续朝着微量化、高深度和高通量的方向持续发展。而单细胞蛋白组学，可以为疾病的异质性提供可解决的视角。药物扰动实验，捕捉单细胞群的功能是前沿和热点，但灵敏度是瓶颈。
因此， Matthias Mann实验室最近开发了一个强大的工作流程，他们称为T-SCP 技术。将小型样品制备与极低流量液相色谱和最新timsTOF SCP相结合，从而在单细胞分析时，实现至少一个数量级的灵敏度提升，实现真正的单细胞蛋白组学。
要想提升，得先有对照。
为了探索灵敏度，Mann采用四极杆质谱, 通过 DDA 采集模式和MaxQuant 分析，从0.8纳克的HeLa 裂解物中鉴定出超过550种蛋白。鉴于单个 HeLa 细胞的蛋白质含量低至150pg，并且考虑到包括蛋白质消化在内的样品制备过程中不可避免的损失。只找到550说明灵敏度还不够。
Mann指出，至少需要将灵敏度提高一个数量级，才实现真正的单细胞蛋白质组学。我们先记住550这个数字，这个是优化前。
对于单细胞蛋白质组实验的灵敏度，优化关键点在哪里？三个因素：电离效率、进入真空系统的传输效率和仪器的离子利用率。
Mann首先开发了一个更强的离子源，引入了全新的离子光学元件，并优化了检测器电压等参数。这使得离子电流增加了4倍多。
接下来，Mann将0个、一个和最多6个HeLa细胞分拣到不同的384孔中，分别进行蛋白处理，并在这个改良的质谱仪（也就是布鲁克tims SCP的原型机）上进行分析，在一个、两个和六个细胞中分别定性到了843、1279和1890个蛋白质。
它们之间结果也有了比较。
和6个细胞的结果相比，单细胞结果的定量精度和准确度下降并不明显。而丰度排序图显示，和6个细胞的结果对应，单细胞蛋白质组优先映射到丰度较高的部分，表明蛋白质组的覆盖率取决于LC-MS的整体灵敏度。
在分析单细胞和六个细胞实验间的共享肽的谱图后可以发现，即使在单细胞水平上依然可以观察到清晰一致的同位素分布模式和较高的信噪比，信号强度也符合按照细胞计数强度比的趋势。
图2
A ：优化仪器以后，原始信号增加
B ：对1至6个 单HeLa细胞的蛋白质进行定量
C：六细胞重复实验的定量再现性
D：与C相同，为两个独立的单细胞
E：蛋白质信号的排序，单细胞中的定量蛋白用橙色，6细胞用蓝色表示
F：母离子同位素模式的原始MS1级谱图，并在单细胞（顶部）和六细胞实验（底部）中都存在
由于电喷雾（ES）与浓度有关，灵敏度随着流速的降低而增加；然而，当流速降低后稳健性又会出现挑战。Mann改进了色谱系统，发现可以低至25纳升/分钟的流速下工作稳定，但以100纳升/分钟为标准，性能有更好保障。
Mann实验室，1纳克=多少蛋白？
基于MS的T-SCP技术，需要先通过蛋白质分离和重溶进行无损失的样品制备，然后进行胰蛋白酶消化和肽的纯化后进入MS分析。当极低流量的色谱法和diaPASEF采集模式一起，可从仅1纳克中识别和定量了超过3900个HeLa蛋白质，具有高可重复性。
与Mann优化前从相同的上样量只能识别到550个蛋白质相比，有了大幅增加。在选定的扫描模式下重复，数据完整性为92%，变异系数（CV）<10%。这表明diaPASEF在极低的样品量下也有显著的优势。
从仅1纳克的蛋白质中识别和定量蛋白质
在选定的扫描模式下，数据完整性为92%，变异系数（CV）<10%
一旦提高了灵敏度，T-SCP这个蛋白质组学工作流程找到了一个应用场景。
在单细胞水平上检测出对药物扰动的生物反应。细胞周期是一个被充分研究的生物过程，经常被用作单细胞研究的测试案例。
Mann用几种药物刺激HeLa细胞，产生四个富含特定细胞周期阶段的细胞群。
对每个单细胞的蛋白进行数量统计，最多可达2083个。
G1的中位数1,018 ，G1/S为1,932，G2为1,572，和G2/M为1,705。
根据蛋白量判断，G2细胞大约比G1细胞大1.8倍；因此，T-SCP这个蛋白质组学工作流程正确地反映了增殖状态，同时突出了每个细胞周期阶段内的异质性显著。
接下来看PCA。
为了能够直接比较单细胞蛋白质组，并消除因每个细胞的蛋白质总量和鉴定不同而造成的蛋白质丰度差异，不同细胞周期状态的蛋白质组在主成分分析（PCA）图中分组。
除了这些药物干扰的细胞，Mann还检测了来自两个独立细胞培养批次的200多个未药物处理的细胞。这些非同步细胞的蛋白质组在细胞周期状态中分布良好，而不同批次的细胞在G1和G2阶段富集。
这凸显了与生物差异相比，技术差异几乎可以忽略。T-SCP数据集覆盖到了很多关键蛋白，而这些蛋白经过注释发现和许多细胞区室、膜和参与生物调节、代谢、运输和信号转导相关。
虽然这里主要展示了单细胞总蛋白质组测量，但在工作流程中实现的灵敏度增益在任何样本有限的情况下都是有利的。这包括对其他化合物类别的研究，例如代谢物或药物、来自少量细胞或组织的翻译后修饰，以及直接从石蜡包埋福尔马林固定 (FFPE) 病理标本进行的检测。
Mann指出， 对于蛋白质，结果的好坏取决于CV ，而CV仅取决于测量的灵敏度。目前基于 MS 的蛋白质组学的灵敏度已经有了大幅提高，势必会造成不同平台的检测差异， 这种差异在未来肯定会增加。
灵敏度，是临床蛋白样本的关键。对于易算团队，也有一些提高整体灵敏度的经验：
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