文章题目：Plasma proteomics identifies leukemia inhibitory factor (LIF) as a novel predictive biomarker of immune-checkpoint blockade resistance：血浆蛋白组学发现免疫治疗的疗效标志物

https://doi.org/10.1016/j.annonc.2021.08.1748

场景

抗-PD-L1免疫治疗耐药的疗效标志物

目的：找到新的、可靠的生物标志物，以避免给那些预计疗效较低的癌症患者开具可能具有毒性和高成本的免疫检查点阻断剂(ICBs)治疗方案。

方法

该研究采用了蛋白质组学的方法，分析了两个独立前瞻性队列两个前瞻性晚期癌症患者的分析（发现：MATCH-R;验证队列：PREMIS）中癌症患者治疗前的血浆样本的蛋白质组，并通过 Cox 比例风险模型研究了蛋白质血浆水平、临床获益率、无进展生存期和总生存期之间的关系。

 本研究旨在确定与抗PD-L1免疫治疗耐药有关的生物标志物，并在一个发现队列中进行评估，然后在另一个验证队列中进行验证。研究收集了癌症患者治疗前（Pre-Tx）的血浆样本和配对的肿瘤活检样本，这些血浆样本（95名患者）进行了全面的蛋白质组学分析，定量到1463种蛋白质。肿瘤活检样本用于（i）RNA测序以评估肿瘤免疫基因表达谱（52名患者），以及（ii）免疫组化检测肿瘤PD-L1表达（TPS分数）、CD8 T细胞密度和第三淋巴结构的存在（59名患者）。

计算数据随后被测试与临床数据的关联，包括临床结局。效果好（DCB）被认为是患者获得完全或部分缓解，但也包括稳定疾病和无进展生存期（PFS）>12个月的患者。效果差 （NDB）被认为是患者出现进展性疾病或稳定性疾病，PFS≤12个月。

最佳选定的生物标志物在接受PD1/PDL1治疗的292名患者的独立验证队列中进行了研究。

发现

1、在发现队列和验证队列中，白血病抑制因子(LIF)的升高与ICB治疗的癌症患者的不良临床结局相关，并且这种关联独立于其他预后因素。

2、LIF的循环水平与肿瘤微环境中的三级淋巴结构的存在呈负相关。

证明了LIF作为潜在的抗肿瘤免疫抑制因子的作用，建议针对LIF或其通路的治疗可能提高免疫治疗疗效。

具体分析

数据采集：

对发现队列的95个患者样本血浆样本在抗PD-L1治疗前采集；对验证队列的292名患者血浆样本在接收接受PD1/PDL1治疗之后采集。


发现队列：

1、通过蛋白质组定量1463种蛋白质

2、潜在标志物的生存分析

  • 计算每个蛋白的中位数值，将样本根据中位数进行分类，形成高值组和低值组

  • 评估高表达和低表达之间中位PFS及相应置信区间

  • 计算log rank p值，比较高表达和低表达组生存差异（PFS）是否具有统计学意义

  • 找到已知与免疫治疗下癌症患者临床结局相关的多种细胞因子重点分析

  • 最显著的蛋白LIF：分析LIF低水平组和LIF高水平组之间OS、PFS和置信区间，比较高水平和低水平之间的log rank 生存差异

 

3、基线血浆LIF水平在NDB和DCB患者中的差异

  • 患者治疗疗效：分为NDB（n= 72，疗效好）和DCB（n = 23，疗效不好）患者

  • 对NDB患者和DCB患者的基线血浆LIF水平数据，两组数据进行描述性统计，包括样本数（n）、均值、标准差等。
    使用Wilcoxon秩和检验（也称为Mann-Whitney U检验）来比较NDB组和DCB组之间基线血浆LIF水平的差异，计算得到的P值，以评估差异的显著性。

 


4、基线血浆LIF水平与DCB或NCB之间的相关性

  • 将所有患者根据基线血浆LIF水平分成高水平组和低水平组。

  • 统计高水平组和低水平组中统计DCB或NCB的患者数量。

  • 计算每个组中经历DCB或NCB的患者的比例。

  • 使用卡方检验或Fisher精确检验来比较高水平组和低水平组之间经历DCB或NCB的患者

  • 比例的差异，计算得到的P值，以评估差异的显著性

 

5、统计ROC

进行一元时间相关的受试者工作特征（ROC）曲线分析，计算基线LIF水平在预测临床效益中的性能，使用曲线下面积（AUC）作为评价指标。确认其具有强大的预测价值： Circle indicates the point on the curve for the best separation of two groups (LIFLow and LIFHigh).

 

因此，基线血清 LIF 水平与接受免疫检查点阻滞剂治疗的癌症患者的不良临床结局相关

活检样本获得的发现：LIF预测免疫检查点阻滞剂治疗的癌症患者的预后，与PD-L1表达状态无关、LIF 血清水平与特定的肿瘤微环境特征和 TLS 的存在有关


验证队列（治疗后）：

在接受免疫检查点阻滞剂治疗的癌症患者验证队列中，基线血清 LIF 水平预测结局独立于其他预后因素

6、收集来自PREMIS研究（NCT03984318）中292名患者的血浆样本，作为验证队列检测血浆蛋白表达

7、比较LIF低水平组和LIF高水平组之间的客观缓解率、DCB率（卡方检验）、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）， 评估差异的显著性。

8、绘制ROC曲线，并计算其下面积（AUC）来评估基线LIF水平的预测价值。

Circle indicates the point on the curve for the best separation of two groups (LIFLow and LIFHigh).

 

9、为了确定LIF血浆水平是否独立地与PFS和OS相关。为此，我们使用了Cox回归模型进行单变量和多变量分析，以确定预后因素。在单变量分析中，检查了多个潜在的影响因素，包括年龄、性别、肿瘤类型、转移部位数量、是否有肝转移、身体状况（PS）、先前治疗次数以及LIF血浆水平。

发现LIF血浆水平与PFS和OS都显著相关（P值小于0.05），表明LIF血浆水平可能与患者的预后有关。接下来，进行了多变量分析，考虑了与PFS和OS相关的变量（P值小于0.05），包括LIF血浆水平、年龄、肿瘤类型和身体状况。结果表明LIF血浆水平与PFS和OS的相关性保持独立（P值小于0.05），表明LIF血浆水平独立地影响PFS和OS。 

最后：结果表明，LIF可能是癌症免疫治疗耐药性的关键因素，因此表明靶向LIF轴可能代表一种有希望的方法，以提高ICB在癌症患者中的疗效，特别是在以高血浆水平LIF为特征的患者中检测以获益。

结果延伸

1、免疫治疗后的样本是否也应该采集血浆做血浆蛋白组的疗效监测？本文的方法是将患者分为疗效好和疗效差两组，然后比较两组患者在治疗前血浆LIF表达水平的差异，进而探究LIF表达是否与免疫治疗的疗效相关。通过卡方检验或Fisher精确检验比较高水平组和低水平组之间经历DCB或NCB的患者比例的差异，使用卡方检验或Fisher精确检验来比较高水平组和低水平组之间经历DCB或NCB的患者比例的差异，计算得到的P值差异显著，说明LIF表达水平与免疫治疗的疗效具有一定的相关性。

免疫治疗后的样本也应该采集血浆做血浆蛋白组的疗效监测。因为免疫治疗后会对患者的免疫系统产生影响，血浆中的蛋白质组成也会发生变化。通过采集治疗前和治疗后的血浆样本，可以比较两者之间的差异，综合评估免疫治疗的疗效。


2、蛋白表达检测的验证是非常重要的，它可以帮助确定潜在目标蛋白是否确实存在。如果挑选的潜在目标蛋白比较多，那么考虑采取PRM方法进行验证也是一种可行的方案。

但是，在进行下一步分析之前，需要先考虑目标蛋白的性质。如果目标蛋白是已知与免疫治疗下癌症患者临床结局相关的细胞因子，那么可以采用重点分析的方法进行分析。但如果目标蛋白是低水平表达的蛋白或目标不是细胞因子，那么需要采取其他筛选策略进行下一步分析，如果表达验证不到，那么结论也会丧失意义。因此，在进行实验之前，需要仔细规划实验方案，确保实验的可靠性和准确性。如果实验结果存在不确定性，需要进行重复实验以确保结果的可靠性。


3、下一步计划采用IP-MS技术抓取和功能实验目标蛋白的互作蛋白。如果我们获得的标志物数量不止一个，而是五个，那么在安排实验时需要考虑以下几个因素：首先，根据前期研究结果和预测的生物学功能，优先考虑哪个标志物进行实验；其次，设计合理的对照组，以便比较目标蛋白和互作蛋白之间的差异，同时需要考虑是否需要进行时间点、浓度等方面的变化实验；最后，分析实验结果，找出目标蛋白的主要互作蛋白，并进一步进行生物学功能验证。