知否？知否？单抗分析中的Intact Mass数据解读
写在前面的话：我记得在我踏入生物制药行业的第一天，我当时的boss就跟我说，Intact Mass分析是质谱解析生物药的第一步，万不可小看这一步，这个数据对于整个表征分析都极为关键。这句话给我留下了非常深刻的印象，因为那会儿的我觉得不就是解个分子量么，有什么难的。然而，在我接触了大量的单抗药、ADC、重糖基化的蛋白药、双抗后，我才领悟了这句话的内涵，也越发了解了Intact Mass分析的江湖地位。不论是在Discovery初期的筛选，还是进展到后面报审批的阶段，如果Intact Mass做不好，其它的也就免谈。Intact Mass结果中所包含的丰富的信息量也着实能够给我们带来大量的启示，指导接下来的研发工作，表征的也好，工艺改进的也罢。因此，今天，我就想从一个质谱工作者的角度出发，跟行业内上下游相关研究的兄弟姐妹们讲讲最基础的分子量报告解读。
我们如果上google搜索intact mass monoclonal antibody（当然，度娘我没试过，大家感兴趣的话，可以自行尝试下是否会出现“百家号”哈，呵呵），首页上会出现各大质谱仪器厂商关于采用LC-MS进行单抗药物分子量表征的花式technical notes。我觉得写得都很不错，值得做抗体药质谱分析的同学们认真拜读。但对于做表达和纯化的同学们来说，有些术语过于专业，跨界得厉害，他们对于分子量检测的理解和需求很简单：就是我把样品送给你，可不可以拜托你告诉我，我表达纯化出来的抗体是不是我预想的那一个，至于中间的步骤嘛，我只要知道个大概就行。那么，我们就从他们的需求出发，简单的聊一下，用质谱进行单抗分子量检测到底是个什么样的过程，当我们拿到质谱分析的结果之后，又该如何来解读我们的数据？
单抗分子量检测大致分为以下五步：样品前处理、色谱分离、质谱采集、谱图去卷积、分子量解读。我们以反相色谱串联高精度质谱检测单克抗轻重链分子量为例（如图1所示）：单抗样品经DTT还原之后，采用反相色谱进行分离，得到分属于轻链和重链的两个峰，经由一级质谱扫描采集其原始质谱图，通过仪器自带软件在目标分子量范围进行去卷积的计算，获得我们的最终结果，图中轻链的实测分子量为23XXX，而重链的实测分子量为49XXX。一般来讲，前面的样品前处理、色谱分离、质谱采集、谱图去卷积的过程都将由专业的质谱分析人员进行操作。你只需要把你的需求告诉他们（例如：我想要知道我表达的抗体跟我预想的一样不一样，那么建议你做去糖完整抗体分子量和去糖轻重链分子量检测；又如，我想知道我表达出来的单抗的糖型分布，那么你可以选择做完整抗体分子量检测或者轻重链分子量检测），实验人员会根据你的需求制定样品前处理过程（去糖/不去糖，还原/不还原，又或者是否需要将完整抗体分解成小一点的亚结构片段如Fab/Fc之类），继而采用不同的色谱分离模式（反相/体积排阻），设定合适的质谱采集参数（不同的仪器厂家设置略有不同，需要注意的是扫描范围会根据目标分子的大小进行设定，例如图1所示，普通单抗的轻重链出峰m/z大概在1000到3000，分子量大一些的ADC或者双抗的完整分子量检测m/z的扫描范围应该设得更高一些），接下来对采集到的原始谱图使用合适的软件进行去卷积处理（同样的，对于不同软件的参数设置，不同厂家的算法略有不同，需要注意的是输入的m/z和输出的分子量范围要设定合理，否则容易误导软件的计算，在去卷积结果中出现假峰）。最后，实验人员交到你手上的就是我们图1所展示的去卷积谱图结果了。
可能很多同学之前并不了解质谱，即便是拿到了这个结果，也不知道这是什么意思，她/他甚至会问，这是我的抗体的轻重链么？要回答这个问题，也很简单。你把你的抗体的理论氨基酸序列告诉做质谱分析的同事，请他/她帮忙计算一下其理论分子量，再与实验数据进行比对，下一个最终的定论即可。当然，在某些情况下，基于某种考虑，可能并不太方便透露你的抗体氨基酸序列，那么你也可以选择自己来计算它的理论分子量。下面就跟大家分享一下我本人是怎样做的。这个是我常用的网站：www.expasy.org。如图2所示，进入主页面之后，点击左边Categories下方的proteomics，网页上即会出现Databases和Tools两栏，在Tools一栏往下滚动，按字母排序找到PeptideMass，点进去，就出现了我们计算肽段和蛋白质理论分子量的页面（图3，当然，你也可以选择直接输入这个网址www.expasy.org/peptide_mass）。
在图3展示的这个页面的方框内，粘贴上你的抗体蛋白的理论氨基酸序列，其它都保持默认参数设置不变，点击Perform按钮，进入如图4所示的页面。其实这个在线程序的用处不止于此，它最大的作用是拿来计算理论酶切肽段，所以网页上展示的内容非常多，但在我们这里，只需要看图4中圈起来的理论平均分子量即可。对于示例抗体的重链来说，它的理论分子量则为46889 Da。但素，我要开始划重点了，开始划重点了，开始划重点了，重要的事情说三遍。我们拿到手里的分子量结果常常跟计算出来的理论分子量差特别多，Why?
这就要从单抗的结构讲起了。我们以人源的IgG1单抗为例，它的结构如图5所展示的那样，是由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链，通过链间的四对二硫键链接而成，每条重链本身存在四对链内二硫键，而每条轻链本身则含有两对链内二硫键。如果采用DTT对单抗进行还原处理，一般来讲，链间的二硫键是最先被打开的，其次才是链内二硫键。在重链的CH2结构域上有一个N-糖基化修饰位点，轻重链N端如果以Q起始，会发生较高比例的环化（脱掉一份子的H2O），重链C端如果以K结尾，则会发生较大比例的切除（掉一个K）。对于简单的分子量结果解读来讲，明白以上几点就足够了。当然，单抗上也会有其他类型的翻译后修饰，但是我们要知道，大多数的翻译后修饰的发生比例都不高，而质谱进行分子量检测的分辨率大多会在2万以内，所以这些翻译后修饰最后贡献到去卷积结果上的体现都不明显。我们在第一步的分子量确证实验中暂时还不需要去了解。
综上，对于切除N-糖的单抗还原分子量来讲，重链的计算过程是这样的：
1）采用刚才所说的网页，计算得到其理论氨基酸序列平均分子量；
2）减去形成四对链内二硫键所脱掉的H（-4×2 Da）；
3）如果N端以Q起始，则减去环化脱去的一分子的H2O（-18 Da）；
4）如果C端以K结尾，则减去K的残基分子量（-128 Da）。
对于切除N-糖的单抗还原分子量来讲，轻链的计算过程是这样的：
1）采用刚才所说的网页，计算得到其理论氨基酸序列平均分子量；
2）减去形成两对链内二硫键所脱掉的H（-2×2 Da）；
3）如果N端以Q起始，则减去环化脱去的一分子的H2O（-18 Da）。
在得到了轻重链的理论平均分子量后，我们再来计算切除N-糖的单抗完整分子量就简单多了：2×重链理论分子量 (2条相同的重链) + 2×轻链理论分子量 (2条相同的轻链) - 4×2 Da (形成4对链间二硫键脱掉的H的质量)。
而讲完不含糖链的单抗的轻重链和完整分子量是如何计算的，我们还会遇到一个常见的问题，那就是当我们不做切糖处理时，如何从分子量结果去解析单抗的糖型呢？这就需要我们进一步了解单抗中常见的糖链结构了。如图6所示，左图展示了抗体中常见的N-糖链的结构和名称，右边的表格则总结了在单抗的两条重链上中可能出现的糖链组合（两条重链上所带的糖链可能一样，也可能不一样）及它们的平均分子量。
这样的话，一切准备工作就绪，我们现在既知道了完整单抗的理论分子量，也知道了各种糖型的分子量，那么就可以在得到的去卷积谱图上对各种糖型进行标注了，正如图7所示。到这里为止，最常见的单抗分子量检测的几种结果都跟大家讲了一遍，这下子是不是不用再为你的分子量报告解读而烦恼了呢？
笔者按：现如今，越来越多的生物制药企业搭建了大分子质谱分析表征平台，方便、快捷、高精度的质谱检测结果大大的加速了药物的研发和工艺改进工作。不过，在这个浮躁而物质化的社会，药企人员的频繁流动在所难免，由此给质谱分析的同学们带来的一大问题就是需要不停的给提交分析需求的新同事普及质谱结果的解读方式。我希望能够用最浅显的语言，以最直白的方式，告诉更多的人究竟应该如何去看这个分子量的检测报告，所以有了这篇文章的出现。然而我想，其实不论是仪器生产厂商也好，软件开发厂商也好，大家都在不断地改进自己的产品，以适应客户的需求。在这个讲求效率的时代，很快的，以往传统的这一套数据处理流程会越发的简化，慢慢被取代，必然有一天，人工智能会自己去解读质谱数据，直接得出答案。也不知是该期待这一天的早日到来还是晚一点再来呢？
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