糖蛋白组最新研究进展以及易算解决方案

蛋白的糖基化修饰其参与调控转录，细胞识别，免疫反应，肿瘤侵袭等重要生命活动过程，对健康、疾病等具有深远的影响。不同蛋白的糖基化的类型和水平给蛋白功能带来十分巨大的变化。在位点特异水平上和蛋白质组层面上，精准的大规模蛋白质糖基化表征对理解这些生物学功能是至关重要的。目前，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）因其精准和灵敏的特点成为当下完整糖肽（同时获得糖链，肽段，糖基化位点信息）研究的主流方法。

然而，糖基化修饰作为目前最复杂的蛋白后修饰，不但会产生宏观不均一性（每个蛋白上可能有多个后修饰位点），更会产生微观不均一性（每个位点上可能有几十甚至上百种不同的糖基化基团）。这些特点给完整糖肽的获取、鉴定通量和数据分析带来极大的挑战，大大限制了糖蛋白组的研究，使其发展远滞后于常规的蛋白组水平。在鉴定通量问题上，大多数完整糖肽解析技术会采用多种质谱碎裂方式或多种实验技术的结合以获取充足的肽段和糖链的信息，但也因此损失了鉴定的通量；在数据分析方面，目前应用较广的商业化软件Byonic更适用于小规模的糖肽分析，对于大规模的糖肽样品分析，仍然缺乏好的解析软件和方法。此外，目前主流的分析策略中还有很大一部分是将糖链，去糖基化肽段，完整糖肽分割开来检测，在用不同的软件对这些信息分析后整合在一起，以获得完整糖肽的信息。例如用Byonic软件分析糖肽，SimGlycan软件分析糖链。目前绝大多数的解析软件只对糖链或者肽段进行单方面的质控，这样的策略会严重影响数据的整体的产出以及准确度。在此，也引出了一个很重要的问题---糖肽鉴定中的假阳性评估。糖肽鉴定中一直存在着高假阳性（FDR）的问题，精准的糖肽鉴定FDR评估应该是糖链，多肽以及完整糖肽三个层面的匹配。

pGlyco2.0

该研究展示了高通量、高质量的完整N-糖肽分析流程，并为精准糖蛋白质组分析提供了新的分析工具。在2016年，该团队已经在Scientific Report上报道了pGlyco软件，率先提出了从糖链、多肽、完整糖肽三个层面全方位地对糖肽数据进行精准质控的方法。如今的pGlyco 2.0是对前期版本的优化和提升。文章一方面经过严格的筛选和分析后，选择优化的阶梯能量HCD（higer-energy collisional dissociation）作为糖肽的质谱谱图采集方法，兼顾了完整糖肽数据采集的完整性和效率；另一方面开发了具有准确质控的完整糖肽分析软件pGlyco 2.0。从前期数据采集到后期数据分析，建立了高通量，高质量的N-糖蛋白分析流程。使用该流程对5种小鼠组织中的N-糖蛋白位点进行鉴定，将1988年发表的955个位点数据集提升到了含有10,009个位点特异的N-糖肽数据集，且该数据集是目前最大的糖肽数据集。

上图是质谱碎裂模式优化前后的完整糖肽谱图。a图是采用了优化后的阶梯能量HCD碎裂的质谱谱图，b图是采用传统单一能量质谱碎裂方法对同一糖肽碎裂的谱图，J表示发生N-糖基化的位点。

pGlyco2.0 在完整糖肽鉴定的工作流程设计如下图所示：

值得一提的是，在评估假阳性率（FDR）时，研究人员开发了基于重标技术的糖肽数据质控流程（下图），首次在复杂样品（酵母）中，客观地比较了不同检索引擎汇报糖肽结果的假阳性率：pGlyco2.0的假阳性率不到1%，大大领先当前其他软件。

说完了最新的研究，我们来聊一聊易算在糖蛋白研究领域可以帮您做什么工作。在N-糖蛋白研究中，分为三类具体的工作，N-糖链/组学分析，单个/大规模N-糖位点鉴定，特定/高通量完整N-糖肽分析。

由于糖蛋白含量低，通常需要进行富集，常见的富集方法和特点，我们总结如下：

其中前三种为推荐常用的富集方法。

易算未知糖蛋白分析流程