药物研发领域：LiP-MS和TPP技术助力药物靶标发现

在药物开发过程中，药物靶点及作用机制仍然是最大的挑战。检测药物靶点不仅有助于理解药物的作用机制，还可以解释药物活性与生物学之间的关系，同时可以预测潜在的副作用和耐药机制，以及发现新的药物靶点。目前有多种不同技术进行药靶检测，尤其是随着化学蛋白质组学的发展，涌现出了一些新的、先进的、利用质谱技术对小分子-蛋白结合的检测方法。这里我们将深入探讨两种基于化学蛋白质组新方法——LiP-MS（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry）和TPP（Thermal Proteome Profiling），可以精准地寻找和发现药物靶标蛋白。同时，易算生物主推的高效、准确和实用性显著的【单点LiP-MS+TPP】组合策略将推动药物研发进入一个全新的时代。我们公司提供这些先进技术的全套解决方案，为您的科研旅程添翼。

一、技术摘要

目标：小分子-蛋白结合靶点寻找

研究材料：细胞，客户提供的小分子

易算推荐最佳分析策略：小分子与细胞孵育后分别进行Thermal Proteome Profiling（TPP）及Limited Proteolysis （LiP）处理，经质谱检测后整合分析得到潜在药靶结合区域

为什么是TPP+LiP-MS：一次性分析成千上万的蛋白且能够大大降低实验难度和成本，同时也可以提高靶标识别的准确性和分辨率。

1.1 Limited Proteolysis （LiP）

基于小分子结合蛋白后相对于原蛋白形成蛋白构象及位阻的变化，从而形成不同的酶切位点，通过质谱检测这个差异来推测结合位置的技术。

不同于传统的定量蛋白质组学，LiP实验包括两个关键的酶切步骤：首先在非变性条件下进行蛋白酶K（PK）的切割，当药物小分子与蛋白结合时，其在空间上可能会造成某些区域的位阻，使其不易被PK酶切。接下来，蛋白进行变性处理并用Trypsin酶切。通过对这些样品进行质谱分析，可以识别和鉴定出差异性的肽段。

为了保证数据的可靠性，还需要进行外参样品的分析：仅经过胰蛋白酶消化后，进入质谱分析。这些数据将作为一个外部参考，帮助进行背景扣除。

最终，精确地定量样品组和对照组之间肽段丰度的差异从而推断蛋白结构差异。由于药物结合带来的空间位阻导致某些蛋白结构区域无法被蛋白水解酶触及，使加药组与对照组之间的限制性水解产物肽段丰度不同，这些丰度差异的限制性水解位点很可能含药物结合区域信息。

该过程的图示如下：

1.2 Thermal Proteome Profiling（TPP）

当靶蛋白与药物发生结合形成复合物时，靶蛋白的热稳定性增强，通过比较游离态和结合态的靶蛋白热熔化曲线中点的位移（TM），即可判断蛋白是否为药物的靶点。

通常情况下，蛋白受热将发生不可逆的构象破坏并发生聚沉。而与药物分子结合能够增强特定靶标蛋白构象的稳定性，使得这些蛋白在热激下更不易于发生聚沉。TPP（热蛋白质组）方法通常在不同温度下热处理来诱导蛋白发生沉淀，随后收集残留的可溶性组分进行定量蛋白质组学分析以获得部分特定蛋白的完整熔解曲线，并最终分析得到目标药物的靶标蛋白。

图源：doi:10.1038/nprot.2015.101

二、易算药靶分析方案

2.1 LiP-MS实验基本流程（细胞）

每个分组各取3个生物学/技术重复的细胞样品
分别进行药物处理和DMSO对照，得到药物处理的本底影响数据
同时进行非限制性酶切（PK）得药物处理及对照实验
得到可能得靶标信息，扣除本底后得到基于LiP-MS技术的药靶列表

备注：不同的细胞系可能对同一药物表现出不同的响应。尽量选择药物已知靶标可能有表达的该疾病同一类型的细胞系，避免在该细胞系因为不表达而无法检出药物靶标蛋白。【注：易算内部实验经验，发现某些药靶蛋白在某些细胞系里面不表达】

单浓度场景：广筛; 多浓度场景：细筛

药物的浓度设置

单浓度：

1）基于关心的药物在目标的细胞系或实验对象的已有文献参考（客户提供），或者

2）客户自己预实验，即有条件可以基于如半最大有效浓度（EC50）等客户内部自己摸索的药物实验的接近值

3）易算默认100μM，基于文献参考doi:10.1039/d2sc03326g

多浓度：考虑S曲线（即剂量-反应曲线）。选择比EC50低的浓度作为低浓度，EC50附近的浓度作为中等浓度，以及高于EC50的浓度作为高浓度。肽段丰度与药物剂量-反应曲线（尤其是EC50附近）的相关性的计算用于进一步筛选药物靶标。

NATURE COMMUNICATIONS | (2020) 11:4200

2.2 TPP实验流程（细胞）

每个分组各取3个生物学/技术重复的细胞样品
进行热降解处理药物孵育及对照样品
进一步进行质谱检测得到可能得靶标信息

TPP有多种流程选择

1）基于温度梯度（TPP-TR）：通过绘制蛋白质热熔变化曲线同时计算有无配体条件下每种蛋白的Tm来筛选靶标。

2）基于浓度梯度（TPP-CCR）：通过绘制每种蛋白质的剂量反应曲线来筛选靶标。

3）基于温度和浓度（TPP-2D）：TPP-TR和TPP-CCR的结合，是当前TPP方法中最准确灵敏的。缺点是成本高，实验复杂。

4）单温度的技术优势：1. 没有建立拟合曲线的需求，降低因不良熔融或稳定性曲线导致的目标鉴定失误风险。2. 降低样品准备和质谱分析的成本和时间。TPP 52°C被选为代表性的变性温度，因为它是蛋白组中蛋白质熔点（Tm）的中位数。这个温度被认为是最佳的，因为它能鉴定出最多的靶蛋白--Anal. Chem. 2023, 95, 13779−13787。

2.3 新方案：TPP+LiP-MS实验流程

实验处理：同样的样本各自进行TPP，LiP-MS实验流程。

数据分析：通过专门的DIA分析软件和LiP-MS+TPP结果筛选打分，得到各自的候选列表（存在非特异性）及共同发现的候选列表（可信度更高）

为何要LiP-MS结合TPP？

LiP-MS和TPP是两种各自独特的靶标筛选技术，同时两者是互补的方法，TPP在检测低丰度蛋白质靶点方面较欠缺，对药物结合时不会改变其溶解行为的靶点不敏感。LiP-MS可以在肽段水平上识别结合序列，但可能受到蛋白质序列覆盖的限制。有研究报道使用两者方法检测到有限数量的overlap，因此结合两种方法来看，可以实现更全面的药物靶点覆盖，并通过测量蛋白质的不同特性来评估药物结合可靠性。（Nature communications, 11(1), 4200. ）。

为什么易算主推【单浓度LiP-MS+单温度TPP】方案？

首先，多浓度或多温度的实验成本非常高（15万-20万），并且由于实验的复杂性和多样性，容易产生不可控的数据偏差。一旦其中某个浓度或温度出现数据异常，整个实验就必须重来。

经过一系列的优化实验后，易算发现单浓度LiP-MS与单温度TPP的组合策略可以显著降低实验难度和成本。同时，这种组合策略还能实现高度准确的靶标分析。

参考一篇文章中使用LiP-MS方法来识别雷帕霉素的已知靶标（doi: 10.1038/s41467-020-18071-x ），原文采用了7个浓度梯度，利用药物剂量梯度，鉴别到了靶标FKBP1A。

易算单点组合策略：鉴定到雷帕霉素的作用靶标

而我们使用LiP-MS+TPP策略来重现识别雷帕霉素的已知靶点，值得强调的是，我们通过使用单点LiP-MS+TPP策略，不仅能够准确地确定雷帕霉素的作用靶标FKBP1A，还能够锁定药物作用的具体区域（黄色区域），这与原文的发现相一致，这证明了单点策略在精确性、成本和实用性上的优越性。

综上所述，单浓度LiP-MS结合单温度TPP为靶标药物研究带来了一个高效、准确和成本效益显著的新方法。

易算【单浓度LiP-MS+单温度TPP】的实验和分析流程

易算Demo实验：TPP + LiP-MS用于识别蛋白质组中的药物靶点和药物结合区域

对LiP-MS和TPP的结果分别筛选差异，然后韦恩图取交集，两种方法筛选到的共有差异蛋白交集对于靶标识别更准确、更可靠，对这些蛋白进行通路富集和互作网络等分析，进一步了解药物结合显著影响的功能和通路，以及药物结合蛋白之间的互作关系，寻找核心的蛋白。还可以通过IPA通路分析聚焦到候选蛋白的信号通路中以排除更多的非特异性靶标。此外，通过肽段Barcode图、Profile图等可以观察由于药物结合或构象变化而发生变化的肽段，追踪肽段丰度的动态变化。

易算分析方案：TPP + LiP-MS用于识别蛋白质组中的药物靶点和药物结合区域

三、 应用场景

药物靶点识别、创新标志物、小分子/蛋白-蛋白互作、蛋白结构/功能变化、遗传扰动等

3.1 ）识别药靶：

使用机器学习算法给出打分值来揭示药物与蛋白结合情况和大致的结合区域范围

Nat Commun.2020 Aug 21;11(1):4200. doi: 10.1038/s41467-020-18071-x.

对HeLa细胞进行给药和不给药处理，第一步通过单浓度LiP-MS设计广筛药物结合靶标，然后再通过多浓度LiP-MS进一步细筛靶标，建立了评分系统，确定这些潜在靶标的优先级，结果发现雷帕霉素的已知靶标是评分排序最靠前的，并且该流程在酿酒酵母中同样适用，多浓度LiP-MS结合评分系统同样可以识别出酿酒酵母中的雷帕霉素已知靶标。进一步将该方法应用于发现灰霉菌杀菌剂的未知靶标，助力解释未知的药物作用模式。

3.2）探究创新标志物：

探索帕金森病（PD）脑脊液（CSF）和大脑中蛋白结构的改变

Nat Struct Mol Biol.2022 Oct;29(10):978-989. doi: 10.1038/s41594-022-00837-0. Epub 2022 Oct 12.

难点：许多人类疾病可以使用血液或其他体液中的生物标记物来进行检测和诊断，但帕金森病不同，迄今临床上还没有发现用于指示这种神经退行性疾病的生物标记物。

分析了帕金森病（PD）患者和健康人脑脊液中蛋白质的结构变化，并揭示变化的确切位置，而传统的蛋白质组测量方法往往只能识别蛋白和对应的丰度，而不记录结构变化。

发现76种在PD患者中结构变化的蛋白，提示并非某些蛋白质存在与否或表达量，而是其所呈现的形状能揭示帕金森病特征。

蛋白质的结构信息比数量信息更能准确区分健康人和PD患者、可提高关键PD蛋白α-synuclein的诊断准确性。下一步对已经发现的标志物进行彻底检测，并使用更大患者群体对其进行验证，以评估它们检测帕金森病的性能，确定帕金森病的亚型，并对疾病的恶化程度作出更准确的预测，或者确定其是否能用于检测其他神经退行性疾病，如阿尔茨海默病。

3.3）揭示蛋白质功能的改变：

利用LiP-MS监测蛋白质丰度和结构变化，比经典蛋白质组学（仅检测蛋白丰度）检测到大量改变的生物过程。

Cell vol. 184,2 (2021): 545-559.e22. doi:10.1016/j.cell.2020.12.021

生物过程由分子间相互作用和化学修饰调节，这些不涉及蛋白水平的改变，因此通过经典蛋白质组学无法检测到。该研究基于有限蛋白水解质谱(LiP-MS)监测热刺激和不刺激、渗透压胁迫和非胁迫的酵母蛋白质丰度变化和结构变化，结果发现，只有1%或更少的蛋白质在刺激后丰度发生变化，而有23％和11％的蛋白在热激和渗透压冲击下发生了结构改变；对结构改变的蛋白质进行了功能富集分析，揭示了酵母对急性应激反应期间的蛋白质结构和功能变化。同时，对8种不同条件下生长的大肠杆菌进行LiP-MS分析，精确地确定结构变化的位置，通过结构变化来推断可能的代谢调节机制，产生新的分子假说。

3.4）TPP结合反向遗传学

将反向遗传学与TPP相结合，以分析遗传扰动对蛋白质丰度和热稳定性的影响。

Nature. 2020 December 01; 588(7838): 473–478

样本和方法：121株大肠杆菌（单基因缺失突变体），共2420个样本（121个突变体×2个重复体×10个温度）进行2D-TPP检测，然后计算每种蛋白质在每个突变体中的丰度变化和热稳定性变化。

结果意义：通过将反向遗传学与TPP相结合，以分析遗传扰动对蛋白质丰度和热稳定性的影响，确定了多种潜在的新的相互作用，也给未知功能蛋白赋予了功能注释。研究发现必需蛋白在不同遗传背景中将改变自身的活性或互作，而非丰度。后续将TPP与代谢组结合，证明了TPP可以捕捉体内的酶活性，为解析细胞代谢状态，揭示酶与代谢途径关联能力提供了独特的视角。

3.5）研究生命活动中常见配体分子的相互作用：

用于系统性地研究细胞周期过程中蛋白质的热稳定性变化和蛋白丰度变化

Cell. 2018 May 31;173(6):1495-1507.e18. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.053. Epub 2018 Apr 26.

证明了在细胞周期的Ｍ期和Ｇ１期之间，细胞中蛋白的热稳定性变化广泛存在。认为细胞生命周期过程中，蛋白丰度变化和蛋白热稳定性变化是相互独立的，细胞周期相关的蛋白热稳定性变化是通过与蛋白丰度无关的机制调控。

四、易算优势

易算团队在质谱数据分析领域拥有超过15年的深厚经验，同时在蛋白质组软件产品的销售、培训和支持方面也有超过10年的实践背景。我们的专家具备超过15年在蛋白质组试剂盒和耗材的使用和开发经验，以及超过10年的色谱和质谱维护、应用和方法开发经验。此外，我们在各类生物学样品处理方法开发和质谱服务售后领域都有超过5年的经验，团队成员总被引次数超过4000次。

代表性论文链接：

https://mp.weixin.qq.com/s/Mu8os_2UF-RBTGsVCvNNXA?from=industrynews&version=4.1.8.6020&platform=win

易算生物是国内最早进行下一代蛋白质组学方案开发、实施的公司。从2017年起就开始着手布局临床样本多组学、大队列蛋白质组、修饰组的技术方法开发并构建了完整的研究和实施方案。国内大量临床研究实验室、CRO企业均引进部署易算的EasyDIA技术方案。本方案围绕高分辨蛋白质质谱形成了完整的上下游配套产品和分析方案，以下几个方向，包括：

A）设备与试剂：

(1)易肽EasyPept AUTO蛋白质前处理自动化工作站：通过精心设计的自动化处理流程能够在数小时内实现大规模蛋白质组样品制备流程，确保数据的一致性、可比性和再现性，从而提高大规模的临床研究的结果可靠性和可重复性。目前已在复旦大学生物医学研究院、中科院生物物理所、北京生命科学园飞镖孵化器、福建孟超肝胆医院和多个CRO公司部署。

(2)易肽EasyPeptTM试剂盒：采用业内最前沿的蛋白提取策略，实现相对于传统方法5-10倍的处理速度提升，大大改善了前处理样品的损失和平行性。对样品量的要求也相对传统方案降低了5-10倍。并且在极限情况下可以实现接近单细胞水平的蛋白质组检测能力。目前已在国内数十个蛋白质组实验室得到了广泛使用。

B）技术与创新：

(3)Next Generation Proteomics——DIA技术能够无遗漏的检测样本中的所有离子信息，避免传统检测DDA方法会出现的低丰度信号遗漏及多样品间谱峰检测不一致的情况。这种无偏性和全面性使DIA技术在复杂样本的蛋白质组学分析中展现出卓越的性能和优势。在结合最先进的质谱硬件和调教的情况下，易算采用国际领先的基于深度学习算法Spectronaut软件，独家开发的的搜索算法Pulsar、人工智能和机器学习技术，在速度，灵敏度和定量结果方面表现出优异的性能，能够自动从大量数据中学习和提取特征，提供更准确的蛋白质定量和鉴定结果，确保了分析结果的高准确性和可重复性。

C）数据分析能力

(4) 专项数据分析能力：为了进一步通过生信分析来筛选药物潜在结合靶标，易算生物打造了LiP-MS和TPP的专项分析平台，可同时分析LiP-MS和TPP数据，该平台的功能模块从数据上传、分析参数设置、数据前处理到统计可视化和功能注释。数据前处理后一键提交分析，6个样本，一秒出分析结果，包含样本比较、差异蛋白筛选、表达量分析到功能分析。