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title: "蛋白质序列确认服务"
author: "omicsolution"
account: "omicsolution"
published_at: "2024-10-22T19:16:39+08:00"
captured_at: "2026-08-27T10:51:45.087970+08:00"
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# 蛋白质序列确认服务
当我们表达目标蛋白进行SDS凝胶电泳分析的时候，会出现目标分子量条带之外的额外条带或者分子量与预期不符的情况。有些情况下条带分子量会略大于目标分子量，那么我们可以怀疑是否发生了N糖基化，这种可以通过额外进行PNGnase F切糖后重新跑胶以确认，如果大很多需要考虑是否形成多聚体或者复合物。但是如果小于理论分子量的位置出现明显条带的话那就很可能是降解或者翻译过程中提前终止了，比如下图。

![图片 1](images/001.png)

这种情况下的确认方式就得用到质谱，也就是我们经常说的LC-MS/MS了，简单讲就是将SDS条带用酶（通常是用胰酶Trypsin）进行酶切（切断K赖氨酸,R精氨酸）成小肽片段进行MS即小肽分子量检测，和MS/MS即片段序列检测确定该条带中蛋白的实际序列。软件将采集到的MS/MS信息和您提供的理论蛋白质序列进行比对，从而找到未检测到的序列部分，推断分子量差异的原因。然而理论非常清晰，实际操作却有各类因素需要考虑，包括：

目标蛋白序列中的酶切特异性氨基酸分布，以下图蛋白为例

![图片 2](images/002.png)

该图是采用Trypsin（切KR）的理论酶切情况，LC-MS/MS的通常适合检测能力大约是6-30个氨基酸长度的多肽，过短或者过长都会导致检测不可靠。因此可以看到红框指示的适合Trypsin酶切的序列大约占比80%左右，但是蛋白质N端和C端都有大段序列没有KR，仅有一小段序列可检出，使该蛋白的序列完整度确认出现风险，万一末端序列未检出，则整个N,C末端连续60多个AA都会难以检测，这种情况下如果我们发现检测结果N端或C端没有序列覆盖，草率的得出结论蛋白N、C端未表达或降解则容易得出错误结论。而我们接着看下面张图，该图是采用Chemotrypsin（酶切氨基酸FLWY）进行理论酶切后可能得到的N,C末端可检测序列覆盖情况。

![图片 3](images/003.png)

虽然理论酶切肽依然较长，但相对于Trypsin来说短了很多，使其可检测率大大提高，因此采用Chemotrypsin可以更好的判断是否存在N,C端缺失的情况。需要注意的是，所有类型的特异性酶种类中，Trypsin是最最常用，成本最低且酶切效果最好的酶，其他任何酶的效果都远不如Trypsin，因此草率的仅使用Chemotrypsin的话容易得到比较低的序列覆盖结果从而可能使得其他位置的序列难以检测。因此我们通常采用Trypsin和Chemotrypsin分别酶切及LC-MS/MS检测，互相印证结果的实验方案以提高实验成功率。

综上所述，我们给出的实验方案如下：

![图片 4](images/004.png)