蛋白质组对刚入门的研究者来说感觉难于上青天，一个很简单的定性实验都能折腾很久，而对于经验丰富的工程师来说，一周就能搞定10来个iTRAQ实验。排除仪器本身因素，在样品制备、数据分析中其实有很多细节因素会显著地影响最终得到的结果，这些就是所谓质谱实验需要进行质量控制的范畴。易算接下来在本专题系列中，着重从污染物的来源、排查和去除，以及如何评估质谱结果好坏来进行讨论。

质控专题共分三期内容：

1. 质谱污染的来源与防控篇

2. 质谱原始数据中的污染物信息篇

3. 质谱数据质控篇——Quic软件介绍

1.      其中最常见的就是角蛋白污染问题。角蛋白主要来自于毛发、皮肤、衣服等。角蛋白质谱信号压制样品的蛋白质信号，引起低丰度蛋白信号丢失。导致色谱柱污染和超载。同样一些实验室经常会用到的标准蛋白残留在系统内也会影响后续实验的信号。

有些搜库软件（Maxquant）自带常见污染蛋白的序列库可以提供评估，如需单独提取，则可在此下载相应序列:
http://www.omicsolution.com/wp-content/uploads/2017/07/contaminants_20120713.zip

其中，角蛋白污染无法根除，只能通过一些手段来缓解。

•          实验中佩戴干净的乳胶手套和口罩，以及帽子，避免来自自身毛发、皮肤的角蛋白污染。

•          应当穿着干净实验服，避免来自衣物的动物毛纤维的角蛋白。

其他如BSA等的污染则可以在实验过程中排查引入污染的来源加以去除，尤其有些缺乏经验的研究者在做一些分泌蛋白实验中混入胎牛血清，那么样品很容易就被超高丰度牛蛋白污染。

2.      来自微生物的污染。例如在蛋白抽提过程中使用了细菌生长的水溶液。对于液相系统中水相溶液中微生物的污染，使得梯度分离中出现杂峰，或者在等梯度的情况下增加背景吸收。另外，会堵塞过滤头、喷针、柱子，止回阀失灵，最终导致液相崩溃。对于长时间停机（比如一个周末）未用的液相系统，使用含有10%有机溶剂（例如乙腈或甲醇）的水溶液彻底冲洗管路。

另外，当微生物污染在试剂中发生时，还需要将存放试剂的器皿进行高温高压灭菌和清洗。

这类污染种类多样，往往在质谱检测过程中可以从谱图中看出，有些对质谱鉴定的成功与否有至关重要的影响。常见的有PEG、各种表面活性剂（如SDS、CHAPS、Triton、Tweens、NP-40等），DMSO、来自于样品试剂的盐、离心管污染等，其中一些可以称之为background ions。

如何减少这一类污染，有以下几点：

1.      液质系统使用洁净度和无颗粒物杂质的LC-MS级试剂。

试剂应当是在生产是采用0.2 μm进行预过滤的，但是不要在使用前再次过滤，这样会引入新的污染。

2.      使用超纯水

纯水系统的输出管路如果超过24小时没有水流动，需要打开冲洗20min，以排除微生物增殖。

3.      注意添加试剂的使用量

•          为了降低背景，使用最少量的、高质量流动相添加试剂（例如，添加0.1%的甲酸，而不是1%）。

•          添加试剂的使用可能会引入铁或者其他金属离子。例如乙酸可能包含有大量的金属离子。

•          避免使用无机盐或者在高有机相洗脱中加入添加试剂。这些试剂会在梯度结束时的高有机相产生沉淀。

•          在质谱中，避免使用不挥发性盐类试剂Na+，K+，PO43，推荐使用NH4+，乙酸、甲酸。注意，一些添加试剂与质谱不兼容，请根据各仪器厂商的说明。

•          当流动相的pH超过10，会溶解二氧化硅，所以如果系统中存在石英或者玻璃，避免溶液pH大于10。

4.      储存溶液应该在带盖的干净的玻璃瓶中

•          绝对不要使用塑料容器储存溶液，会引入增塑剂，进而促进有机污染。

•          在硼硅酸盐玻璃瓶中（棕色瓶能减缓微生物生长）储存流动相。

•          如果需要覆盖瓶口，可以使用铝箔，而绝不可使用PARAFILM膜或者其他塑料膜。

•          液相使用的流动相，应该根据自己设置的流速和运行时长，常换常新，并且冲洗系统后进行湿排。

•          实验室任何玻璃器皿应该在使用前洗干净：先用有机溶剂洗，后用水洗，最后用要放置在里面的溶液洗。如果对洁净度要就较高（或者这个容器之前用途不明）时，可以在10%醋酸或者硝酸的水溶液中超声，再用甲醇或乙腈，最后用水洗，该过程重复洗两次以上。

•          作为储存流动相的玻璃器皿要单独清洗和单独存放。

5.      在样品前处理实验中，有可能遇到来自方方面面的污染。

在实验耗材方面：

•          在前处理过程中使用干净的瓶、管、盖、皿，根据产品说明书确定没有污染物，不要选择纸包装的样品瓶和盖子，因为纸制品可能带来各类型的污染。

•          确定样品瓶盖子内的垫片不使用包含塑料和粘合剂的材料，推荐PTFE材料。

•          多孔板注意增塑剂的浸出（例如diisooctylphthalates）。

•          实验中使用的手套，应当使用无颗粒、无粉的非乳胶手套。包括在接触液相系统中流动相的进口部分和样品时，都应该戴手套。

•          色谱柱可以捕获颗粒、沉淀的蛋白以及其他有机污染物，这些污染物可通过增加操作压力或改变色谱选择性，进而对色谱柱寿命产生不利影响。此外，它们会增加背景噪音。反相色谱柱在高水相条件下平衡了很长时间，或者在低有机相中运行时间过长，会吸附溶液中的杂质，这些杂质可能会在色谱中产生洗脱峰，色谱图也会变得比较“丑”，微量富集效应放大了在UPLC或HPLC中存在的污染物。养成定期清洗色谱柱的习惯。

仪器的使用方面：

•          在样品浓缩、干燥时，注意，如果冷阱有问题，可能会导致泵油反吸，污染样品。

•          液相质谱能够与样品或溶剂能够接触的各种连接处，包括O型圈、管路、止回阀等都应该使用惰性材料，注意聚合物（如聚氯乙烯、PVC）做成的管子可能会析出增塑剂或其他污染物。

另外，还有一类质谱的离子源污染。随着时间的推移质离子源逐渐被未带电的残留物污染，这些污染物不能通过高速电磁场离开离子源，也不能进入真空系统，导致仪器灵敏度的下降。

保持实验室空气的洁净。注意在实验室空气中的化合物会污染LC-MS系统。

•          在实验室空气中常常有硅氧烷，这类化合物可以在一定条件下（例如纳流）造成污染，如429+，445+。