零帧起手，Nature Methods结果轻松重现，来自赛鹰的单细胞奇妙旅程

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2025年第一期Nature Methods就为我们带来了单细胞蛋白质组的盛宴，在2024年初，易算生物和浙大方群教授课题组联手发表的Nature Commun文章将单细胞的定量深度推到了4000PG水平，当然由于实验条件较为苛刻，我们也只能在方老师实验室里实现这样的结果。

图1 方群-易算 24年NC 单细胞结果

（Spectronaut19重分析）

而最新的NM直接将单细胞蛋白质组的深度和通量大大提升了一个水平而且实验方法都来自于商业化解决方案，能够实现实验室间的方法迁移和重现。

图2 NM25年最新单细胞

这种进步显而易见的有利于单细胞蛋白质组学的普及，也给了我们巨大的压力。在我们首先做到近4000PG的单细胞定量结果后，我们并没有止步不前，在25年的春节前夕，终于可以说，单细胞蛋白质组已经不再高不可攀，在匿名好心人帮忙中给留出半天质谱机时后（虽然拒绝了我们再清洗一次质谱的请求），我们当即决定，零帧起手，仿效第二篇（Challenging...）NM文章中的A549实验样式，也试一下A549单细胞的快速检测效果。

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图3 25年NM 技术路线

图4 赛鹰-易算 25年最新测试技术路线

由于赛鹰极其简单的启动步骤，维护难度，所以我们只花了半个上午即可完成样品准备，操作培训仅需10分钟即可上手，再略等半个下午等待酶解完毕，更换Aurora 15cm色谱柱，质谱装上FAIMS调试，无须除盐便能直接上样。

图5 赛鹰-易算技术路线时间点

赛鹰除了极其简单的样品准备流程，另一大优势便是所见即所得。所有操作过程均录像、拍照，确保所有细胞信息均准确记录。

图6 赛鹰单细胞挑选记录

25微米标准尺寸（SCP）

30微米较大尺寸（Large）

10-15微米微型细胞（tiny）

聚团细胞（diff）

疑似死细胞

取完细胞后再取一次周围环境液体

3种尺寸同框

参考NM文章（财力有限，没做那么多个），我们直接选择25微米左右尺寸细胞作为标准单细胞（SCP），其他尺寸（tiny、large、diff）、死细胞及周围环境（dead、deadENV）等作为对比组，共取了24种不同样品（+1个A549标准品对照）进行测试。后续采用Vanquish Neo（15cm Aurora色谱柱），FAIMS+Astral（赛默飞标准SCP方法），Spectronaut（19.5 directDIA+，swissprot human 20K蛋白，BGS Default）进行分析，总共耗时1天。

结果如下

我们的分析方法和NM文章中directDIA+策略完全一致，那么结果如何呢？

为了确保比较方法一致性，我们重新用Spectronaut19.5再分析了一遍A549单细胞数据（共66个单细胞，数据库、参数保持一致）

图7 易算-赛鹰与NM A549结果对比

易算-赛鹰结果  平均定量5641PG，共定量6000PG （去除死细胞及周围环境蛋白）

NM A549结果  平均3415PG，共5266PG

易算-赛鹰定量热图： 25微米单细胞，35微米单细胞，15微米单细胞及细胞团（去除死细胞及周围环境蛋白）

NM A549  15-30微米 共66个细胞定量热图

易算-赛鹰 18个单细胞（去除死细胞）母离子缺失值为17.3%

NM A549 66个A549细胞 母离子缺失值为59%

易算-赛鹰结果，最右侧为死细胞及周围环境蛋白定量热图

易算-赛鹰 PCA 可以看到死细胞（dead，正下方）和死细胞周围环境（deadEnv，左上角）的蛋白结果与正常单细胞（右上角）结果有显著差异

结论