高分文章思路 | Nature Metabolism：人类脂肪生成的时空蛋白质组图谱
文章题目：A spatiotemporal proteomic map of human adipogenesis 文章来源：Nat Metab (2024). https://doi.org/10.1038/s42255-024-01025-8 文章特色：将多个时间点的蛋白质组学分析与空间 PCP 方法相结合以绘制整个脂肪生成过程中的细胞重排图，突出了分化过程中蛋白质丰度和位置转移的重要性
文章概述
文章背景：一个健康的成年人大约有10-25公斤的脂肪储备。WAT（白色脂肪组织）的特征决定了对健康的影响。肥大型WAT与胰岛素抵抗和炎症水平高有关，小型的WAT则与较低的代谢疾病风险相关。
切入点：尽管转录组研究帮助人们去理解脂肪细胞异质性以及脂肪生成的过程，但蛋白水平的表达变化、活性调节仍然理解不完整，尤其是目前对脂肪细胞分化过程中亚细胞重组和蛋白质定位变化的研究还有很多节点待挖掘。
采样特征：多时间点取样通过四种人类脂肪细胞模型，分析了不同阶段下，脂肪生成过程中的蛋白动态变化，以及脂肪细胞如何通过细胞器和代谢途径的重组来促进生成。
关键蛋白：有一个蛋白C19orf12，在文章中引起注意。它在脂肪细胞分化过程中表达增加，并且在细胞内有特定的定位——定位于脂滴（LD）与线粒体的接触区域。当C19orf12的功能被抑制时，观察到脂滴的堆积增加，这暗示C19orf12可以调节脂肪存储。此外，患者队列中，WAT也就是白色脂肪组织中C19orf12的表达水平与肥胖相关的临床参数负相关。这一发现进一步证实了C19orf12在人类脂肪细胞中脂质存储和代谢健康中的重要角色。
一、取样特点
两种样本类型：
1）细胞模型（Four models）：四种不同的人类脂肪前体细胞模型被用于实验，包括两种非永生化细胞（SGBS和hAPC）以及两种永生化细胞（TERT-hAPC和hWA）。这些细胞经过处理后能够分化成脂肪细胞。对这四种细胞模型进行了从诱导分化的第一天起至14天内的蛋白质组分析，以跨越整个脂肪生成过程。
2）对照样本（Primary samples）：七位捐赠者的pACs、SVF和WAT这三种细胞。作为上述脂肪生成过程的参考点。
LC-MS信号跨越了五个数量级的丰度范围；Spectronaut分析定量了四种细胞模型（SGBS/hAPC/TERT-hAPC/hWA）中的蛋白鉴定数量范围在5,979-7,061，捐赠者对照样本（pAC/SVF/WAT）中的蛋白鉴定数量3,638-6,403，整体鉴定8,268个蛋白。
PCA的结果证实了蛋白质组学数据能够反映出在体外（四种细胞模型）与体内（pAC/SVF/WAT）沿分化轨迹的细胞状态转变，这一点在PCA的组分1和组分2中得到体现。
在诱导分化后，有几种关键的marker蛋白（与先前研究中确定的早期脂肪生成标志物）在前 24 小时内水平发生变化。在所有四种模型中，大约38%的蛋白在分化过程中经历了重塑。
二、空间蛋白质组的实验
这里提到PCP的技术-分析细胞器内蛋白质的定位。
细胞首先通过机械方式裂解，然后通过密度梯度离心分离出不同的细胞器。接下来，利用液相色谱-质谱（LC-MS）技术在不同密度梯度分数中定量蛋白质，以生成它们的丰度谱。这个方法可以得到蛋白的空间分布，由分离过程中与特定细胞器相关的蛋白质的丰度做预测而获得。
三、生信流程
搜库：采用了Spectronaut软件（由Biognosys开发）分析DIA原始文件，directDIA搜索方法针对Uniprot人类数据库进行搜索。 数据预处理与差异比较：对定量数据log2转换，保留至少在一个条件下具有两个有效值的蛋白；width-adjusted以及缺失值填充方式为 normal distribution with a downshift of 1.8 and a width of 0.3；用ANOVA方差分析或双侧Student's t检验来确定差异表达蛋白； 时间点轨迹分析：选取所有细胞模型中共有的时间点进行分析，不共有的时间点从相关性分析中排除；对z-score转换后的时间轨迹执行基于欧氏距离的监督层次聚类分析，计算每个z-score转换后的蛋白质时间轨迹在不同细胞模型间的成对皮尔森相关性。在所有细胞模型组合中表现出正相关的蛋白质被定义为具有保守的时间轨迹。 PCP的细胞器分析：做完数据归一化，预测蛋白定位细胞器的工具是SVM。思路是根据已知实验数据和蛋白质组的数据建立一组细胞器marker蛋白的列表，其中也包括特定于LD（脂滴）的marker。用这组标记来训练SVM-根据蛋白质的表达强度预测它们所在细胞器的计算模型。将不同细胞状态（如成熟脂肪细胞和前脂肪细胞）的数据合并，进行细胞器的预测分析。通过比较蛋白质在实验中的实际分布与计算上可能的细胞器分布的相似度，来确定它们可能位于的细胞器。接下来，筛选哪些至少被分配到一个细胞器的蛋白，使用α值来评估一个蛋白质可能同时存在于多个细胞器的程度，α值为 0 的蛋白质被认为是对单个细胞器有特异性。如果蛋白质在不同细胞状态下被分配到了不同的细胞器，那么我们认为这个蛋白质的位置发生变化。
四、空间蛋白组的分析结果
4.1 脂肪生成的空间蛋白质组图谱
通过1小时 LC-MS DIA实验以及采用支持向量机（SVM）的监督学习方法，在对脂肪细胞和前脂肪细胞的研究中，分别鉴定出5,530和5,675个蛋白质的位置，其中在脂肪细胞中有4,452个蛋白质，而在前脂肪细胞中有4,912个蛋白质被准确地归类到了特定的细胞器簇中。值得注意的是，超过半数的蛋白质与至少两种细胞器有关，这一发现与之前的研究结果相符合。
有了蛋白的空间定位，就可以继续往下分析蛋白定位的变化了。
4.2 脂肪生成中的蛋白定位变化
通过支持向量机（SVM）分析，发现在未分化的祖细胞和分化的脂肪细胞之间，有1,323个蛋白质展现出了不同的细胞器定位，其中654个在两个数据集中高可信。在这份列表中，可以找到在脂肪生成过程中已知会发生变化的蛋白质，比如PLIN2，ABHD5，确实像先前报道的那样，其定位转移到脂滴（LDs），而EWSR1蛋白则转移到细胞核。
此外，通过整合时序蛋白质组数据，研究揭示了脂肪生成过程中细胞器成分的变化，如线粒体、内质网、内体和脂滴蛋白质的比例增加，细胞质和核蛋白的比例减少。这就说明在脂肪生成的过程中，细胞停止分裂并减少对整体蛋白质合成的需求，同时增加线粒体蛋白的产生。大约20%的定位蛋白质组在脂肪生成过程中发生了转移，这个动作在细胞分化中扮演着至关重要的角色。
4.3 蛋白质定位和丰度变化驱动细胞重编程
接下来就更有趣了。为了理解细胞器如何应对脂肪生成过程，研究人员对分配给特定细胞器的时间蛋白质谱进行了聚类分析以及通路分析，看看哪些蛋白质在这个过程中被派到了新的岗位上，以及它们是怎么帮助细胞做出脂肪的。具体来说有两个大的发现。
首先是有关BCAA（一种氨基酸）的处理方式完全改了方向。原本在细胞的早期，BCAA参与的是帮助细胞生长必需的核苷酸的制造。但在脂肪生成时，细胞决定把BCAA带到线粒体里去，不再用来做核苷酸，而是转化成柠檬酸和乙酰辅酶A，这两样东西是做脂肪的原料。这个改变靠的是提升线粒体里分解BCAA的酶的数量，以及一个关键蛋白BCAT2的大迁移，从细胞的其他地方搬到了线粒体里。
第二个改变是单碳代谢的调整，这也是帮助细胞制造脂肪所需的。细胞通过调整蛋白质的位置和数量，让这个代谢途径开始专注于生产NADPH——另一种脂肪合成必需的原料。这种调整让细胞质里的代谢流向了丝氨酸的分解和NADPH的生产。
这些发现和最新的代谢组研究结果吻合，证实了BCAA代谢在脂肪生成中的角色关键；成熟的脂肪细胞比起它们的前体，更积极地吸收和合成丝氨酸，很可能是为了生产更多的NADPH。
这些研究揭示了在脂肪细胞成熟的过程中，细胞如何通过改变蛋白质的工作地点和处理物质的方式，来为生产脂肪做好准备。
4.4 C19orf12蛋白调控脂肪细胞脂质周转
在比较的是SGBS细胞（一种人类前脂肪细胞系，能够分化成脂肪细胞）和hAPCs（从人类白色脂肪组织分离的脂肪前体细胞）两种细胞模型的脂滴（LDs）蛋白质组时，C19orf12引起了研究者的注意。这两种模型都是研究脂肪生成和脂肪细胞功能的重要工具。
C19orf12的表达在几个方面格外突出：首先，它被发现是在两种脂肪细胞模型中共有的脂滴蛋白质之一，这意味着无论是在SGBS细胞还是hAPCs细胞中，C19orf12都与脂滴有关联；其次，它是仅限于脂肪细胞的脂滴蛋白质中的一员，这表明它可能在脂肪细胞特有的脂质代谢中发挥作用；最重要的是，C19orf12在所有检测的人类脂肪生成模型中都展现了一致的时间变化轨迹，并且相比其他候选蛋白，它在细胞系和成熟脂肪细胞（pACs）中的mRNA表达量和蛋白质水平都有显著增加，特别是与支持组织细胞（SVFs）相比，这暗示了它在脂肪细胞的脂质储存中可能扮演着潜在的功能角色。这种在不同细胞状态下持续增加的表达模式表明C19orf12在脂肪生成过程中可能起到关键作用。
知道这个蛋白很重要，接下来应该怎么办？
文章通过免疫共沉淀进一步探索了C19orf12，发现它与多个涉及线粒体蛋白导入的蛋白有关，尤其是与TOM复合体的几个组成部分相互作用。这表明C19orf12可能在脂滴和线粒体之间的接触点上发挥作用，影响脂质的处理和代谢。
接下来，通过敲减C19orf12基因的实验，观察到脂质代谢和脂解作用的显著变化，以及脂联素分泌的增加。这些实验结果进一步证实了C19orf12在调控脂肪细胞中脂质周转和代谢中的重要作用。
五、文章总结
取样特点：通过对四种不同的人类脂肪前体细胞模型在脂肪生成全程的多时间点取样分析，研究揭示了细胞分化过程中蛋白质组的动态变化。同时，将这些数据与来自七位捐赠者的初级样本进行对比，为研究提供了体内脂肪生成的参考。
空间蛋白质组实验：利用蛋白质相关性分析（PCP）技术--通过细胞机械裂解和密度梯度离心，结合液相色谱-质谱（LC-MS）技术完成。这种方法能够基于蛋白质与特定细胞器的关联性，再加上机器学习的方法，预测其可能的空间分布。
关键蛋白的挑选思路：C19orf12特异性表达筛选+ 时间轨迹分析 + 免疫共沉淀 + 敲除或过表达，从而一步步证实了其作用。这个框架对于其他做蛋白组学的同仁也适用。
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