龙年巨献第一篇：浙江大学方群团队最新研究Nat Commun亮相 | PiSPA技术在单细胞蛋白质组领域实现3000+PG新高度

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单细胞技术在过去几年里发展迅速，单细胞蛋白质组学技术逐渐成为了研究热点。目前基于质谱的传统蛋白质组分析技术能在单次检测中从大量细胞里鉴定约5000-7000种蛋白质，但在单细胞水平上却显得力不从心，其蛋白质鉴定数量显著减少，每个细胞仅能鉴定约1000种蛋白质。此外，传统的样本前处理操作大多在微升级反应体系中进行，会导致明显的样品损失，严重限制单细胞蛋白质组学的鉴定深度。

为解决这一问题，也有采用纳升级原位微反应器进行样本前处理的尝试，但大多数反应体系须基于微流控芯片或自主构建的类似装置，并需要特殊的样品进样装置及额外操作。尽管这样可以提升结果，但想要进一步提高蛋白质鉴定深度、简化设备和操作，实现单细胞水平的全流程蛋白质组学分析仍面临巨大挑战。

另外最新款的质谱如tims Ultra，Astral等在质谱硬件上实现了灵敏度的极大提升，但除了预算成本的大大增加外，样品制备和数据分析同样面临挑战，否则可能还不如本文采用第一代tims的单细胞定量结果。

本研究的第一作者是王宇和关致颖，这两位作者对研究做出了同等贡献。通讯作者是浙江大学化学系方群教授。易算生物作为跨学科团队中的一员， 在此研究中为质谱数据分析提供了生信技术支持，确保了数据处理的准确性和高效性。

综合来看，PiSPA工作流程使得高精度的液体操控、单细胞的精确处理以及先进LC-TIMS-QTOF MS技术融为一体，重新定义了单细胞蛋白质组学分析。

在PiSPA平台中，单细胞捕获过程利用了基于SODA（Sequential Operation Droplet Array）技术开发的微流控液体处理系统，此技术最初由作者团队在2013年开发，用于实现自动化的皮升至纳升级液体操作，并已广泛应用于高通量筛选、单细胞分析等领域。该系统由以下部分组成：

在这里，PiSPA平台没有使用以前的SODA 系统中常用的液滴阵列芯片，而是使用了带有锥形底部的内插管阵列作为纳升反应器以提高系统的可操作性和可靠性，且便于使用后续的液相色谱自动进样。在这一改进型机器人系统的基础上，团队提出了基于“Pick-up”模式的自动化细胞分选和样品前处理方法，包括以下三个步骤：

单细胞识别：利用自动化的明场或荧光成像技术，基于细胞的明场表观特征或标记的荧光信号，从细胞悬浮液样本中识别目标细胞。

细胞捕获：通过与高精度注射泵连接的锥形毛细管探针，使任意单个细胞得以被精准地捕获。

细胞分配：捕获后，使用同一个毛细管探针将目标细胞精准地分配（注射）到一个预先准备好的内插管中。这个内插管随后用于细胞的多步骤前处理，包括细胞裂解、蛋白质还原、烷基化、酶解和反应终止等步骤。

上述过程的自动化和优化条件保证了至少95%的单细胞分配成功率。

与以往使用微芯片作为微反应器不同，PiSPA工作流程采用商品化内插管直接兼容LC-MS系统的自动进样器，这种设计不仅简化了操作流程，还通过内插管的锥形尖底设计，解决了纳升级反应溶液加载的难题，同时通过在样品瓶外添加水和密封盖，形成高湿度环境以抑制反应溶液在加热过程中的快速蒸发。

接下来，单细胞处理后提取出的肽会进入LC-TIMS-QTOF MS技术的实验流程，这个流程特别优化了质谱分析步骤，通过精细调整的液相色谱分离条件和质谱采集参数，实现高效的蛋白质组分离和高准确度的质谱分析。

二、PiSPA 平台在单个哺乳动物细胞蛋白质组分析中的应用

利用PiSPA工作流程，团队在多种细胞中实现了超高深度定量检测。通过DIA和DDA模式对A549、HeLa和U2OS三种细胞的分析，DIA模式下鉴定的蛋白质组数量显著高于DDA模式。

在DIA模式下，通过使用DIA-NN的MBR算法，可从A549、HeLa和U2OS三种细胞类型的单细胞样本中定量到平均3008、2926和2259种蛋白质，展示了PiSPA平台在单细胞蛋白鉴定的数量优势；在DIA（MBR）模式下，有2869、2772和1889种蛋白质在至少80%的A549、HeLa和U2OS单细胞样本中被重复识别和定量，而只有638、722和1103种蛋白质的重复识别率低于20%。这说明大多数蛋白质可以在绝大多数样本中被稳定检测到，反映了PiSPA平台结果的一致性和可靠性。

UMAP降维分析显示，三种细胞样本能被清晰聚类。在DIA 和 DDA 模式下，蛋白质丰度范围分别跨越了近 5 个和 4 个数量级。一些重要但丰度较低的蛋白质只能在 DIA 模式下定量，如错配修复内切酶 PMS2 和 E3 泛素蛋白连接酶NEDD4。

三、LC-MS 系统定量准确度和精确度评估

首先，通过对不同浓度的HeLa细胞裂解物进行定量。研究团队观察到蛋白质丰度倍数随着蛋白量的增加而线性增长，R²值高达0.9995，体现了系统的高灵敏度和准确性；此外，变异系数（CV）的显著降低反映了定量精确度的提升，从200 pg的HeLa裂解物的25.6%降至1 ng裂解物的14.9%。

进一步的验证实验中，通过向单细胞样品添加不同比例的酵母和大肠杆菌肽段，分析结果显示蛋白质丰度倍数中位数与理论值高度一致（相对差异范围从-2%至+15%），证明了系统的定量准确性和可靠性。

最后，通过分析0至10个HeLa细胞样品，特别是在DIA模式下，虽然蛋白鉴定数目并非随细胞数线性增加，但蛋白丰度倍数变化与细胞数呈现线性关系，验证了PiSPA系统能够精确控制样品中的细胞数量，并提供准确的蛋白质定量结果。此外，通过分析与“组蛋白”相关蛋白质的丰度变化，进一步展示了PiSPA系统在特异性捕获和蛋白质定量准确性方面的优势。

四、迁移细胞的单细胞蛋白质组分析

为了进一步验证PiSPA方法的实用价值，文章对HeLa细胞培养体系进行划痕实验测试，分别吸取有明显迁移和未发生迁移的HeLa单细胞进行差异定量分析。

通过划痕实验，PiSPA平台选取了具有明显迁移行为的46个细胞和43个对照细胞进行单细胞蛋白质组分析。通过DIA (MBR)模式，分别平均鉴定了迁移细胞和对照细胞的2544和2893种蛋白质。使用UMAP方法，将数据分为三个不同的簇，第一簇主要包含迁移细胞，表现出与细胞迁移相关的蛋白质表达差异；第二和第三簇主要包含对照细胞，显示出不同的蛋白质表达特征。KEGG富集分析找到迁移相关蛋白质，特别是Cdc42, Rac1, 和RhoA等在迁移细胞中的显著上调，揭示了迁移过程中的焦点粘附和肌动蛋白骨架调节通路的激活。这证明了PiSPA平台具有识别细胞迁移关键分子以及有价值靶点的应用潜力。

五、总结

目前，开发能集成全流程操作的单细胞蛋白质组学平台有助于促进技术的实用和普及，已成为一个重要趋势。本研究通过PiSPA工作流程实现了单个哺乳动物细胞中超过3000种蛋白质的精确鉴定和定量，这一成就突破了传统质谱分析在单细胞蛋白质鉴定数量上的限制， PiSPA平台工作流程涵盖了从单细胞的识别和捕获到细胞内蛋白质的消化，最终通过液相色谱-捕集离子淌度谱-四极杆飞行时间质谱仪（LC-TIMS-QTOF MS）进行蛋白质组分析的全过程。通过自动化的操作模式降低了样本处理的复杂度，提高了分析的效率和重复性，体现了单细胞蛋白质组学在精准医学研究中的应用潜力。

文章解读到这里可以告一段落。对于单细胞蛋白分析，本研究成功集成了一系列质谱分析软件来处理和分析质谱数据。包括SpectroMine和DIA-NN等工具。通过这种多软件集成的策略，能够在保持极低假发现率(FDR)的同时，实现肽谱匹配和蛋白质组的高质量鉴定。SpectroMine软件在DDA数据分析方面为本研究提供了强大的数据处理能力，保障了分析结果的高质量输出。针对质谱数据的下游，易算生物还运用了Seurat和clusterProfiler等生物信息学工具，如批次效应校正、差异蛋白质鉴定，以及通过KEGG富集分析探索了关键生物过程和信号通路，为单细胞研究提供了新的研究视角。

文章链接：doi: 10.1038/s41467-024-45659-4.

六、后续进展与最新成果

开篇提到，本研究利用PiSPA工作流程首次实现了单个哺乳动物细胞中达到3000个Protein Group的超高定量深度。

这是一个起点。

随着Spectronaut 18的引入，其Hybrid-DIA模式将单细胞蛋白质组的定量深度推向了一个新高度：整合多个细胞定量数据为机器学习谱图库，单细胞的定量深度实现了史无前例的提升，鉴定数量从大约3000推向到4000+PG/样品。

由于在进行数据采集和分析的时候，Spectronaut尚未对单细胞定量和hybridDIA分析进行优化，仅采用了DIA-NN进行了数据分析。而在2023年Spectronaut推出18版本及支持hybrid谱图库+DIA联合机器学习分析后，单细胞蛋白质组的DIA定量分析再上高峰，我们针对方老师本次3种细胞的DIA定量数据以及结合5、10个细胞的测试数据（多个HeLa细胞的数据作为library）进行Hybrid-DIA流程的重分析。惊喜地发现，无论定量深度、同种或不同种细胞间的定量数量差异均实现了显著提升，由原来的大约3000种PG，提升到了近4000PG，最大定量蛋白数近5000/样品，3种细胞间定量数量差异较大（U2OS的平均2200到A549的2900PG）提升到了差异非常接近（U2OS的平均3500到A549的3900PG）

Spectronaut 18的引入与其Hybrid-DIA模式的应用，将鉴定成果推向了新高度，提高了定量深度，也优化了不同细胞类型间的定量一致性。我们期待与更多的科研人员分享这一进展。

七、易算单细胞蛋白组分析平台即将登场

近期，我们将推出一个创新的单细胞蛋白组学在线分析和结果展示平台，提供给广大研究者使用。

易算生物继推出wkomics悟空云在线计算平台、GlycAP蛋白糖基化分析平台、OmicsCloud多组学数据的整合与结果解读分析平台之后的这一项新产品，整合了一系列针对单细胞蛋白组的分析工具，为疾病的研究提供单细胞层面的生物学见解。

伴随着各类分析的同时，平台也提供各类静态或交互图，通过输入一些条件，帮你从不同角度观察你的单细胞蛋白组数据。

分析示例（部分）

用户可以利用新的功能和改进对既有结果进行重分析，帮助用户重现甚至重新审视自己的结果。该平台提供了质谱DIA数据分析软件Spectronaut、DDA SpectroMine软件的分析插件，做到上下游的分析对接。

在这里，我们想借此机会邀请更多研究人员加入到单细胞蛋白质组学的研究中来。假如你正在或者将要开展质谱蛋白质组学方面的课题，想找到更多更有价值的信息，请你和我们联系。我们还计划推出更多创新方案，诚邀您一起开启这一探索旅程。

上海易算生物科技有限公司，专注于利用LC-MS/MS和生物信息学技术，为客户提供高质量的研究方案。我们与国内顶尖的蛋白质组实验室紧密合作，开发最新的蛋白质组相关技术和产品。从DIA、PRM分析产品、单细胞及极微量蛋白质前处理，低丰度蛋白深度挖掘，糖蛋白质组，宏蛋白质组整体方案实验室落地方案等，易算均有国际前沿水平并在高分杂志上发表成果的技术产品。我们还引入了国外先进的软件和产品，包括来自瑞士Biognosys公司、德国Bruker公司、德国PreOmics公司和澳大利亚IonOpticks公司等，为国内科研机构提供先进可靠的实验及软件解决方案。