2024易算空间蛋白组设计和分析方案

空间蛋白组一直是研究热点。今天给大家带来三个内容，分别是样本类型，文献应用，易算生信方案。

一、样本类型

质谱空间蛋白组的三种取样方式：分别是组织块、组织切片、组织切片+LCM显微切割。

许多人一听到组织块，可能会想到这是传统的癌症与癌旁正常组织的比较方法，认为其空间分辨率不足。但也有很多文章（我下面会提到）会通过取样不同解剖位置的组织块来比较表达差异，揭示空间上的功能分区。此外，组织块取样方法相对简单，便于大规模研究。

• 组织块：从生物体内取出的一部分组织，用作研究和分析的对象。
• 组织切片：将组织样本按照一定的厚度切成薄片然后上质谱前处理和分析。
• 组织切片+LCM显微切割： 在切片的基础上，使用激光捕获显微切割技术(LCM)进一步精确地切割出研究中所需要的特定区域或细胞群，可以从组织样本中获得高纯度的研究对象。

参考一：µPhos: a scalable and sensitive platform for high-dimensional phosphoproteomics

物种：小鼠

样本数量：6只

样本类型：脑组织块（7个脑区）

这是一篇方法学的文章，介绍了一种新的磷酸化蛋白组学流程名为 µPhos，是将细胞裂解、蛋白质酶解和磷酸肽富集整合在一个小的反应容器，使用TiO₂富集磷酸化的肽段，富集后磷酸肽通过洗脱和脱盐处理，准备进行质谱分析。

研究团队将 µPhos 应用于小鼠脑组织的空间磷酸化蛋白质组学分析。从成年小鼠的大脑中解剖出七个区域，包括视觉皮层、内嗅皮层、胼胝体、小脑，以及海马体的三个子区域，每个区域的组织体积在 0.2 到 0.6 mm³ 之间，提取的蛋白量在 10 到 40 µg 之间。

关键图表

在所有脑区域中，共鉴定了约 70,000 个独特的磷酸化位点，海马体单独鉴定了超过 30,000 个磷酸化位点。通过主成分分析，不同的脑区域在磷酸化蛋白质组层面明显分离反映了在发育和功能上的差异。这个方法能够全面定量 GPCR 的磷酸化事件。以 γ-氨基丁酸 B 型受体亚基 2（Gabbr2）为例，检测到了其胞内域的大部分磷酸化位点，并用热土展示了不同脑区域的特异性的磷酸化。

样本数量：3组总共43例

样本类型：脑组织块（4个脑区）

整体框架：从43个研究人中获得了155个样本，这些样本分别来自脑部的四个区域。分为三组，分别是健康对照组（HC，N=11），阿尔茨海默病抗性组（RAD，N=12）以及阿尔茨海默病症状组（ADD，N=20）。做了12组两两比较（RAD与HC、RAD与ADD、ADD与HC之间T检验；四个区域分别比较）。经过DIA质谱蛋白组分析，对蛋白进行鉴定和定量，再通过差异表达和共表达网络WGCNA对数据进行了分析。最后，文章将结果与四个最接近文章研究设计的独立数据集进行了比较。

关键的分析包括：差异分析、韦恩以及与外部数据集一致性比较、与生理指标的相关性分析、WGCNA、功能富集分析。

参考三：A region-resolved proteomic map of the human brain enabled by high-throughput proteomics

揭秘大脑深处：蛋白质组学绘制人脑区域精细蛋白图谱

样本数量：人，1例

样本类型：脑组织块（13个脑区）

组织块数量：38（每个脑区2-3块）

组织块大小：(~5 × 5 × 5 mm) 

这项工作从一个经过福尔马林固定的人类大脑中，收集了13个解剖学上不同的脑区域，超过11,000种蛋白被鉴定到。每个脑区采集了三个约5×5×5毫米的组织块（橄榄核为两个），独立提取蛋白和消化。每个样本分离为48个组分，使用timsTOF HT系统LC-MS/MS分析，每个样品30分钟。

关键图表

饼图、折线、散点展示四种蛋白质富集类别在各脑区的分布.通过对不同脑区域的组织块，识别各区域特异性表达的蛋白质和功能类别，揭示大脑不同区域的生物学差异，比如通过 t-SNE 分析，发现解剖位置接近的脑区域往往具有相似的蛋白质表达模式；64% 的蛋白质在所有 13 个脑区域中都被检测到。6% 的蛋白质只在单个脑区域中检测到，称为区域特异性蛋白。

物种：小鼠

样本类型：脑组织切片（10个脑区）

切片数量：40张（4个连续切片为一组）

客户文章—小鼠空间脑图谱，一种快速微量磷酸化蛋白组学技术的空间分析

文章建立了一种快速、高通量且微量磷酸化蛋白质组学富集方法——miniPhos（100μg蛋白的20%酶解肽用于蛋白组鉴定，80%酶解肽用于磷酸化富集和检测，实现微量样品的多组学分析），这个流程在在小鼠脑切片中获得应用。

关键图表

磷酸化蛋白质组表现出更明显的脑区差异。通过UMAP分析磷酸化位点，发现不同脑区之间有好的分离，磷酸化蛋白质组在脑区间的变异性比全蛋白质组更明显。在各脑区中，鉴定出 52 种特异性表达的蛋白和 281 个特异性的磷酸化蛋白，对其各自进一步功能分析，发现它们显著富集于细胞发育、能量代谢和脑发育的信号传导过程，而且磷酸化层面找到的脑发育富集相关条目更全，表明磷酸化蛋白组分析可以提供更全面和动态的信息。

物种：小鼠

样本类型：眼组织切片显微切割（11个眼区）

切割数量：每眼区至少3个生物学重复

链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112121

研究团队识别并分离了小鼠眼睛 11 个区域样本。总共鉴定了超过 13,000 种蛋白。此外，利用 MALDI-TOF 成像系统和 LC-MS，在区域分辨水平上研究了小鼠眼睛中脂质的表达分布。通过磷酸化蛋白质组学数据，验证了本研究中发现的区域特异性的蛋白质-脂质相互作用网络。最终建立了小鼠眼睛空间多组学数据库。

关键图表

样本数量：2组共45例，分别是对照组和患者组

样本类型：心脏组织显微切割（心肌、微血管各4个区域）

切割数量：47（心肌切割） + 34（微血管切割）

链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110955

为研究新冠感染影响心脏特定解剖部位的机制，获得28 例非 COVID-19（对照组）和 17 例 COVID-19 患者的心脏中获取了四个精准解剖区域——左心房（LA）、左心室（LV）、右心房（RA）和右心室（RV）的样本，进行蛋白鉴定。

结果发现，患者心脏的炎症反应异常激活，不同心脏区域的蛋白质表达存在显著差异，涉及凝血系统紊乱、细胞外基质损伤和基因表达异常等。这些变化可能是导致心功能障碍的严重风险因素。

关键图表

物种：人

样本类型：脑组织切片显微切割（全网格）

切割数量：384

研究亮点：这篇文章通过使用激光捕获显微切割（LCM）技术和质谱分析，在不同的空间分辨率中肿瘤微环境中的蛋白质分布。研究亮点在于，作者在三个不同的空间分辨率上进行采样，从整个肿瘤组织切片到40微米的分辨率。大尺度采样提供了肿瘤整体的蛋白质分布信息，而小尺度采样揭示了细胞层次的精细结构和局部环境的蛋白质表达。研究发现了肿瘤组织中的蛋白质异质性，具体体现在肿瘤实体、肿瘤/非肿瘤边界、免疫细胞浸润区域以及血管周围。

技术流程

首先，组织被放置在与激光捕获显微切割（LCM）兼容的载玻片上。组织样本是人脑肿瘤，从死后的患者那里获得并经授权。在LCM分析阶段细分为384个方形单元。切片的厚度为10微米，这种厚度特别适合进行LCM操作和后续的蛋白质组分析。此外，该组织样本自身具有血管和肿瘤组织等异质性特征。

关键图表

网格的结果详细展示血管及其周围细胞的蛋白质分布。血液蛋白与血管距离呈正相关，空间聚类将组织分为四个主要聚类，不同聚类表现出与血液相关的功能特征。

三、易算生信方案

空间蛋白组生信流程如下，涵盖了组织块、组织切片、LCM显微切割等各类样本类型。

处理原始质谱数据时，我们先通过DIA数据分析软件提取蛋白质表达矩阵，随后重点分析各取样区域的蛋白质识别情况，这包括对比不同区域的蛋白鉴定量、蛋白丰度分布，以及识别样本间的共有与特异蛋白。为确保数据的一致性和可比性，我们对蛋白质强度数据执行了针对性的归一化，基于此步骤进行空间聚类分析、探索蛋白质组别或聚类簇之间差异，以及进行目标基因集功能与通路分析。除了各类个性化的展示，我们也强调了分子的背景调研，缩短从区域特异性表达，到功能分析，再到机制的距离。

以下流程图供诸位参考：

3.1 空间蛋白鉴定相关图表

空间蛋白的原始鉴定统计，除了关心鉴定数量、有没有离群样本以外，我们特别强调了区域之间样本的相关性，区域特异性表达或者特别鉴定到的蛋白，这些蛋白簇或许承担了很重要的功能。

例如，在一个研究中，我们可能发现在特定的组织区域中，某些蛋白质的表达量特别高或者特别低，并且这些蛋白在不同的组织区域之间的表达模式具有相关性，那么后续就可以调出来继续做功能等下游分析。

3.2 空间聚类与biomarker的识别

假如你的设计思路是全切片划分网格的分析，即将整个组织切片划分为M*N个网格，每个格子当作一个要上质谱的对象，那么就需要将各网格单元的蛋白质鉴定还原到它们的原始空间位置来分析。从生信设计上看，可以采取哪些步骤？

1、空间位置-蛋白表达映射: 将质谱得到的蛋白数据与它们在切片上的空间位置进行匹配。

2.空间聚类和单细胞聚类算法：空间聚类算法来识别在空间位置上表达相似或者不同的网格单元集合。也有高分综述提示我们单细胞算法做空间聚类效果不错，因此易算小伙伴也纳入到空间聚类的流程中。

3、特征蛋白：找到聚类簇，可以进一步比较这些簇之间特异性表达的蛋白识别其独特的功能，以及对这些蛋白的空间位置表达模式分布进一步和你已经掌握的空间注释特点（比如浸润，免疫区域等）相结合来解读你的数据。

4 .整合外部数据: 如果有其他类型的数据(如临床数据等),可以结合这些数据进一步丰富分析的深度，尤其是结合临床数据来探索蛋白质表达与疾病进程的关系。

感兴趣的蛋白可以是区域、空间聚类、趋势等特异性表达的蛋白或者蛋白簇。比如说只在某些空间、区域、网格里面特异性的高表达，那么在空间层面研究会很有趣，这种特异性的表达可能指示了这些特定蛋白在该组织或器官的特化功能中发挥作用的重要性。

对于感兴趣的蛋白簇，我们在既往流行的DIA质谱蛋白组生信模块基础上，参考了空间蛋白组的相关数据库，结合已有空间方面的已知蛋白列表，来研究我们自身实验的特定组织或细胞类型中的蛋白质表达模式以及对其进一步做各类注释。

如果您正在寻找一个高效、精准且全面的基于质谱的空间蛋白组学分析解决方案，那么建议您收藏本文，随时参考我们的分析方案。