宏蛋白质组学(Metaproteomics)，即对微生物群落蛋白质进行大规模定性与定量分析，以捕获微生物群落的物种组成、蛋白丰度和生物学功能等信息。为生物医药、食品发酵以及环境科学领域带来价值。

易算生物经过多年研究创新与技术积累，现推出一套全流程的解决方案，假如您正在或者将要开展宏蛋白质组学方面的课题，想找到更多更有价值的信息，请和我们联系。

一


易算特色

对于宏蛋白组研究，重要也是最难的一步就是构建一个合适的蛋白序列数据库。 传统有三个类型建库：公共数据库或基于公共数据库优化建库、基于宏基因组测序数据得建库和基于16S/18S rRNA测序的伪宏基因组数据库。

这些类型的建库需要关注建库序列特异性和注释准确率的问题。易算经过多年探索，针对每一种方法进行了优化与创新，显著提高了宏蛋白鉴定的准确率和效率。目前已发表的建库策略及其应用的相关参考（易算发表）：

1.Long, S., Yang, Y., Shen, C., Wang, Y., Deng, A., Qin, Q., & Qiao, L. (2020). Metaproteomics characterizes human gut microbiome function in colorectal cancer. NPJ Biofilms and Microbiomes, 6(1), 14.

2.Zhao, J., Yang, Y., Chen, L., Zheng, J., Lv, X., Li, D., Fang, Z., Shen, C., Mallawaarachchi, V., Lin, Y., Yu, S., Yang, F., Wang, L., & Qiao, L. (2023). Quantitative metaproteomics reveals composition and metabolism characteristics of microbial communities in Chinese liquor fermentation starters. Frontiers in Microbiology, 13, 1098268.

3.Zhao, J., Yang, Y., Xu, H., Zheng, J., Shen, C., Chen, T., Wang, T., Wang, B., Yi, J., Zhao, D., Wu, E., Qin, Q., Xia, L., & Qiao, L. (2023). Data-independent acquisition boosts quantitative metaproteomics for deep characterization of gut microbiota. NPJ Biofilms and Microbiomes, 9(1), 4.

4.Zhao, J., Yang, Y., Teng, M., Zheng, J., Wang, B., Mallawaarachchi, V., Lin, Y., Fang, Z., Shen, C., Yu, S., Yang, F., Qiao, L., & Wang, L. (2023). Metaproteomics profiling of the microbial communities in fermentation starters (Daqu) during multi-round production of Chinese liquor. Frontiers in Nutrition, 10, 1139836.

5.Wu, E., Yang, Y., Zhao, J., Zheng, J., Wang, X., Shen, C., & Qiao, L. (2024). High-Abundance Protein-Guided Hybrid Spectral Library for Data-Independent Acquisition Metaproteomics. Analytical Chemistry, 96(3), 1029-1037.

6.Wu, E., Mallawaarachchi, V., Zhao, J., Yang, Y., Liu, H., Wang, X., Shen, C., Lin, Y., & Qiao, L. (n.d.). Contigs directed gene annotation (ConDiGA) for accurate protein sequence database construction in metaproteomics. Microbiome 12, 58 (2024）.

具体易算特异性建库特色：基于宏基因组测序采用ConDiGA策略，蛋白注释率显著提高，相比主流方法提升 100% 以上，相关成果发表在《Microbiome》中。整合超过29万的肠道菌群高丰度蛋白（HAPs）构建样本特定的全蛋白质组数据库流程，优化了搜库时间且可准确鉴定微生物群样品的分类组成并实现高效、高灵敏宏蛋白质组分析，相关成果发表在《Analytical Chemistry》。基于16S rRNA结合DDA分级建库提高鉴定深度，相关成果发表在《NPJ Biofilms and Microbiomes》中。


此外，对于上游实验环节以及质谱分析环节，易算优势还包括自动化前处理：采用易肽Auto150工作站升级版，实现从菌群蛋白到肽段的一站式操作，可批量处理96个样本。机器人响应更灵活，除盐和富集效果得到提升。后续采用最新型的质谱Astral或timsTOF，在临床大队列微量样本的宏蛋白质组学分析中具有广阔的应用前景。在数据检索方面，易算特色搜库流程包括高性价比的无谱图库DIA检索以及更深覆盖的合并谱图库DIA检索。

我们解决了宏蛋白质组的全流程技术难点，助力大规模微生物菌群样本的宏蛋白新认知。


二


具体方案和结果展示


1

应用场景及送样量


样本类型

用量

粪便/肠道内容物

3-5g

口腔拭子

3-5个

皮肤刮片

3-5片

唾液样本

2-3ml

发酵液/冲洗液

5-10毫升液体，或1-5克固体

土壤/污泥/腐殖质

5-10克


2

技术路线

宏蛋白质组的研究策略主要分为以下几步：首先对样品进行蛋白提取和酶解；接着利用LC-MS技术对酶解得到的多肽进行检测；然后利用微生物蛋白质组数据库对质谱检测结果进行数据库检索，得到多肽以及蛋白质鉴定结果；最后进行物种定性定量构成等下游生物信息学分析。

菌群蛋白自动化流程

3

自动化蛋白质组前处理


宏蛋白质组的微生物菌群样本组成复杂，含有大量杂质，导致蛋白提取困难且在提取过程中容易损失蛋白质，导致获得的蛋白溶液往往浓度较低，且体系中可能存在高盐或高去垢剂的成分。对于这种微量和复杂的体系，易算采用自研的自动化工作站配合前处理试剂盒，仅需50μg菌群蛋白，2-3小时即可完成96例的菌群蛋白变性、酶解和纯化全过程，直接获得洁净的肽段用于质谱分析。

菌群蛋白前处理自动化流程


4

尖端质谱联合DIA技术优势

宏蛋白质组有两种质谱模式：数据依赖性采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）。DDA对信号强度最高的多个母离子分别进行碎裂和采集；DIA是对所有母离子进行碎裂和检测，具有无偏向性采集的特点，可以更全面的检测菌群蛋白尤其是低丰度蛋白，高重现性和稳定性更适合大队列研究。

Zhao J, Yang Y, Xu H, Qiao L. NPJ Biofilms Microbiomes. 2023 Jan 24;9(1):4. 

23年乔亮课题组发表在《NPJ Biofilms Microbiomes》中的文章，比较了DIA与DDA方法的菌群蛋白鉴定。结果发现，DIA相比非标记的DDA（LFQ-DDA），检测的蛋白质和肽多出约80%和55%；相比标记的DDA（TMT-DDA），DIA定量准确性更优。

仪器方面，我们拥有最新型的捕集离子淌度（TIMS）质谱仪使蛋白质组分析在鉴定深度精度、定量准确性等方面得到全面提升。此外，最新的高分辨Orbitrap Astral质谱平台擅长高通量、高灵敏度和超深度的蛋白质组定量分析。这些尖端质谱设备结合DIA模式的数据采集为进一步挖掘关键蛋白、物种和功能信息提供了可能。



4

数据库检索-多种策略选择


随着软件算法的不断升级，DIA数据检索也迎来更多机会。客户可以根据实验需求选择多种检索策略：

1）传统谱图库策略。对混合样本进行色谱分级和质谱DDA采集先得到DDA鉴定结果，基于这个结果对宏蛋白质组DIA数据进行解析。这种方法可以缩短DIA数据检索的运算时长，同时提高蛋白质的鉴定深度。

2）混合谱图库策略。通过结合DDA和DIA数据进行机器学习，构建一个混合谱图库 （ hybrid spectral library）。利用混合谱图库解析DIA数据可以更高地提升DIA的覆盖深度，显著提升蛋白质鉴定的准确性和全面性。复旦大学乔亮课题组采用该策略重新分析了之前发布的结直肠癌 (CRC) 肠道微生物元蛋白质组数据集，其中包括 14 名 CRC 患者和 14 名对照者的DIA 和分级 DDA 数据。Hybrid混合策略获得了更多的肽段（41,699个蛋白质和187,278个肽段），相比之下，directDIA获得了38,683个蛋白质和163,967个肽段。同时，Hybrid混合策略方法筛选到的差异蛋白更多（分别为5,361个和4,635个），COG功能分析结果与先前报道结果总体一致。

延申阅读：复旦乔亮团队与易算最新研究成果：宏蛋白组建库方法与应用

3）无谱图库策略directDIA。这种方法直接对DIA数据进行分析而不需要预先构建谱图库，基于算法从DIA数据中生成每个母离子的伪二级谱图，然后构建内部谱图库或者伪谱图库，再解析DIA数据。该方法简化了实验流程，节省了成本，在满足大队列高通量的情况下，还能有不错的检测覆盖度。

延申阅读：NPJ BIOFILMS MICROBI|复旦-交大-易算最新合作成果：DIA如何跨过宏蛋白组的第一宇宙速度


如果您的目标是希望实验的高性价比和简便性，directDIA方案将是最佳选择，它能够快速、高效地进行蛋白质定量分析；若您追求对样品中的蛋白质进行更全面的鉴定，推荐选择谱图库DIA方法，充分利用数据，提升鉴定的灵敏度和准确性。无论您选择哪种方案，我们的团队都将为您提供专业的支持和服务，助力您的研究更上一个台阶！


5

数据分析

我们提供基于公共数据库（如UniProt、NCBI-nr）和定制化数据库构建的灵活注释方案。

利用现有的物种分类和功能注释资源，确保蛋白质匹配的效率。此外，我们针对宏基因组和16S rRNA数据，提供样本特异性的蛋白序列数据库构建，能够准确反映样本中的真实微生物群落组成，提升蛋白质鉴定的深度和准确度。

对于宏蛋白组的功能分析和物种构成，我们提供功能和通路的富集分析，以及进一步基于肽的物种注释进一步支持物种多样性分析和高级微生物群落结构的可视化揭示其潜在的生物学意义。

宏蛋白质组数据分析的部分demo展示：


三


易算宏蛋白质组案例介绍


案例1：宏蛋白组学在结直肠癌肠道微生物组功能研究中的应用

(2020). NPJ Biofilms and Microbiomes, 6(1), 14.

技术：粪便宏蛋白组+公共数据库（HMP人肠菌数据库+NCBI nr细菌全库)

内容：直肠癌（CRC）的发展与肠道微生物组的变化紧密相关。本研究从14名CRC患者和14名健康志愿者中收集了粪便样本，定量宏蛋白组学方法识别并定量了91,902个肽段、30,062个肠道微生物蛋白组及195个微生物属。341种蛋白质在CRC患者与健康志愿者间的表达丰度存在显著差异。特别是与铁离子摄取/转运、氧化应激以及DNA复制、重组和修复相关的微生物蛋白在CRC患者的大肠内由于高铁离子浓度和高氧化应激而发生了显著的变化。本研究表明，宏蛋白组学能够提供有关肠道微生物群功能信息。

课题设计路线图

结果：宏蛋白组学显示了CRC患者与健康对照的肠菌蛋白丰度差异，并且CRC 患者肠菌蛋白与铁摄入/运输（27个）和氧化应激（42个）相关

案例2/3：宏蛋白质组学揭示白酒发酵大曲特征

(2023). Frontiers in Nutrition, 10:1139836. 比较了6道工序×7例重复的42例茅台酒曲宏蛋白组，并结合PRM靶向验证了特定代谢酶活性；

(2022). Frontiers in Microbiology, 13:1098268. 比较了3种类型×3个季节×10例重复的90例茅台酒曲宏蛋白组。

技术：酒曲宏蛋白组+宏基因数据库+PRM验证

内容：采用DIA定量宏蛋白质组方法研究了42例和90例茅台酒曲样本的菌群组成和蛋白功能谱，分别定量到3,009和12155个蛋白质。组内稳定的蛋白数量说明DIA检测结果的高度稳定性，以及表明该流程在大样本队列研究中的潜力。然后生信分析关键菌、酶和通路的丰度变化：第一篇通过物种分析发现优势菌芽孢杆菌在第5、6道工序中丰度最高。通过eggNOG注释及PRM定量发现糖化酶在第5、6道工序中较低。对差异蛋白进行功能分析发现，氨基酸代谢在第5、6道工序中上调。第二篇采用相似地生信分析流程，结果发现白大曲具有较高的菌群多样性和季节稳定性。黄大曲夏季的糖化酶丰度较高。黑大曲秋季的碳水化合物降解活跃。 

课题设计路线图

结果：与糖化过程和茅台白酒风味物质形成有关的通路和酶。（左）氨基酸代谢在第5、6道工序（G3）中上调；（右）秋季黑大曲的糖酵解和柠檬酸循环相关酶具有更高表达。

案例4：directDIA 定量宏蛋白质组学研究肠道微生物群及其相关疾病发病机制

(2023). NPJ Biofilms and Microbiomes, 9(1), 4.

技术：粪便宏蛋白组+宏基因组 / 16S测序数据库 

内容：在本研究中，我们采纳了directDIA技术，并与LFQ-DDA和TMT作比较，结果发现在识别覆盖度、鉴定准确性及定量精度方面均优于其他质谱定量方法。文章还重点展示了宏蛋白组学中研究肠道微生物群及其相关疾病病理学的应用。样本来自轻度认知障碍（MCI）患者和胰腺癌（PC）患者，以及相应的对照组。联合宏基因组测序进行轻度认知障碍（MCI）患者样本分析；联合16SrRNA测序进行胰腺癌（PC）患者样本分析。然后进行差异蛋白筛选、物种分类和功能分析。结果发现，MCI患者和对照组之间有1581个差异蛋白，大多数来自Clostridia、Gammaproteobacteria和Bacteroidetes。在与核苷酸转运和代谢、细菌外膜组分生物合成以及蛋白质转运和伴侣相关的蛋白在MCI患者中相对较少。PC样本也做了类似的分析流程。

课题设计路线图

结果：（左）MCI患者与对照组的差异蛋白及其物种分类和COG注释。（右）PC患者与对照的物种丰度差异


案例5：HAPs-hyblibDIA--肠道微生物物种的专用高丰度蛋白质数据库

(2024). Analytical Chemistry, 96(3), 1029-1037.

技术：宏蛋白组+基于公共数据的建库新策略

内容： 本研究提出了一种基于高丰度蛋白的混合库策略（HAPs-hyblibDIA）用来分析DIA宏蛋白组数据。不需要有16S rRNA序列信息或者宏基因组的序列信息。文章主要比较了HAPs数据库_vs_宏基因组数据库；hyblibDIA谱图库策略_vs_directDIA谱图库策略。通过在人工合成菌群样本和人类肠道微生物样本中的评估，展示了该策略在识别微生物样本分类组成方面的准确性和灵敏度，且所鉴定的肽段与基于宏基因组测序数据库鉴定的肽段有很大的重叠，并且可以鉴定宏基因组未检测到的物种的蛋白质。此外，通过对结直肠癌患者及对照组的人类肠道微生物样本的分析，验证了HAPs-hyblibDIA策略在生物医学研究中的适用性。

基于高丰度蛋白的Hybrid谱图库方法（HAPs-hyblibDIA）来构建蛋白序列数据库

 

结果：HAPs-hyblibDIA流程在宏蛋白质组学分析中增强了肽覆盖深度


案例6：ConDiGA（重叠群注释指导的基因注释）：基于宏基因组精准构建宏蛋白组序列数据库

(2024). Microbiome 12, 58 .

技术：宏蛋白组+基于宏基因组的构建蛋白序列库新方法（ConDiGA） 

我们开发了一种基于宏基因组数据的精确分类注释流程，这项研究采用重叠群注释指导的基因注释（Contigs Directed Gene Annotation, ConDiGA）方法。ConDiGA技术与现有的流行注释方法（传统方法1和2）相比较，显示出在注释的准确性、尤其是物种级别的精确分类注释方面的显著优势。1）在12种已知的细菌合成的微生物群落样本的基准测试中，ConDiGA方法的表现优于其他工具，同样在2）真实的粪便样本以及3）模拟微生物群落和粪便样本的混合数据集上也表现出高效性和高稳定性。

ConDiGA 的代码可在 GitHub 上开放访问https://github.com/metagentools/condiga


基于宏基因组的构建蛋白序列库新方法（ConDiGA）


通过计算混合了合成微生物群落和粪便样本的宏基因组和宏蛋白组数据，评估ConDiGA方法。结果显示，ConDiGA在宏蛋白质组分析中表现最佳，尤其是结合Kaiju注释工具，证明了其在提高蛋白质组注释覆盖率、低丰度物种注释灵敏度方面的优势。


更详细的实操方案和产品工具请看下图

好了，以上就是今天的内容。假如你正在或者将要开展宏蛋白质组学方面的课题，想找到更多更有价值的方案，请您和我们联系。

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在数据分析和国际软件方面，我们自主研发了EasyDIA综合数据处理平台，对液相系统、质谱仪器运行状态、定性结果、定量结果等多个方面进行质控，集成了质谱定量数据分析过程中所用的统计方法，支持分析结果的交互式或静态式的展示与下载功能，有利于支撑大队列的高效运转。我们还引入了国外先进的软件和产品，包括来自瑞士Biognosys公司、德国Bruker公司、德国PreOmics公司和澳大利亚IonOpticks公司等，为国内科研机构提供先进可靠的实验及软件解决方案。