2025年了，蛋白质组定量精度和深度可以既要又要了么？

不想看完全文的可以先看我的结论：还有很多要努力的。

20年前，我们做蛋白质定量看的是丰度差异，1个月只能做几个样品。

而结果不是那么准，通量不是那么高。

19年后的2024年，我写了篇公众号回顾了下蛋白质定量进展：Olsen老师在2023年发表的NBT文章，采用40分钟Astral，800ng上样，3物种混合定量可以检测到~13000PG，其中人蛋白8000，大肠杆菌1200，酵母4200个蛋白左右。

而CV则可以实现<20%占比约90%。

然而我们发现越来越多的人追求通量（也就是成本），使得如此优秀的定性、定量方法几乎无人使用（40min分离），我所见到的几乎都采用的是180SPD（约6min有效分离梯度），在如此高强度

过了一年多，Zoom来了，Olsen老师的最新预印本也来了

，让我们来看看到底蛋白质组定量现在做到啥程度了，有啥进步没？不过由于数据还未上传，我们只能间接分析文章中的数据来管中窥豹了。

首先我们可以看到通量已经卷到了300和500SPD了，分别对应当年180和300SPD的能力。Zoom如何采用最新硬件技术大大降低离子累积时间及提升谱图处理能力的这边按下不表（自己看原文去）。今天主要想来看看我们做蛋白质组的终极目标：定量表现。

很遗憾，虽然定性都做到了500SPD下7000+的深度，但毕竟定性不能当饭吃，对应的定量精确性评估却仍然采用了50SPD，也就是大约26分钟的分离梯度（这个问题其实很大，容易误导读者）

可以看到，从40分钟降低到26分钟后，Astral的结果几乎没变而Zoom提升了8.9%的定性数量。和上一篇文章相比，大肠杆菌鉴定量大大提升，人和酵母蛋白（包括zoom）都变少了，可以得出结论，Olsen老师用的不是同一批样品。

我们现在常用的定量benchmark分布图则如下：

2023年Astral

2025年，很遗憾，这次的物种混合比发生了更改，我没有办法将两次结果进行对应，而且预印本分辨率低，看不清SD值，不过从density plot可以看出来，用了2年的质谱的定量可靠性还是略有下降的。

文章中关于定量的讨论就大概这些了，可以初步得出结论：新一代Zoom的定性深度再上一层楼，而定量精度上来说进展有限。那么我们能做些什么呢？

大家有没有发现这些文献在分析定量精度和准度的时候有两个问题：

1. 定性总是高通量，定量总是低通量？

    这个问题很好解答，因为缩短梯度对定量的影响比定性更大。

2. 评价定量总是连续进样而非实际日常我们要做的日间比较？

    因为中间上了100多个实际样品对LC和MS的可靠性和可重复性影响不小，因此发表的文章总是回避以上2个因素的影响，当然的确也很难控制变量。但毕竟我们日常进行生物学研究的时候哪来那么理想的实验条件呢？如果我们做蛋白质组技术的人不去测试实际情况，那做生物的、医学的更不可能有条件了解当下高通量下，以及日间蛋白质组质谱的定量情况了。

这件事情当仁不让只能我们来挑战下了，不过我司条件有限，木有zoom也木有AIP，只能基于当下硬件，做点更贴近实际的测试了。我们选择了目前满负荷日常跑样的A和B质谱，液相采用Vanquish Neo+Aurora15cm，Spectronaut20默认参数（定量改成Gene Group）每日插入2针不同掺比的人、大肠杆菌、酵母蛋白混样（人蛋白含量不变，另两个物种两组间为3倍含量差异即log2=1.6），样品制备采用易肽micro试剂盒，连续进行3天日间重复，重复间全部在跑其他项目样品。当然由于中间插入的样品不尽相同，质谱性能参数，年份也完全不一样，该测试不够严谨，只能为大家给出一个参考建议。

首先定性及色谱表现相关结果如下：

*如果你问为何A质谱 MS2DPPP少却不用MS1定量？答案是：测了，结果更差。

由于是间隔24小时进样，因此我们的测试结果一定差于Olsen老师数据，但更加贴合实际日常应用条件。相信大家对连续多日的质谱稳定性有了更好的信心了，因此有些老师非要10个样品插入个QC的操作有点过度QC了。

然后就是更重要也是更核心的定量了：

首先我们看下蛋白CV<20%，<10%的数量

B质谱 7分钟

A质谱8分钟

A质谱14分钟

可以看出来拉长梯度对更好的CV帮助巨大，B质谱7分钟和A质谱14分钟的CV表现相当。日间CV的确比连续进样CV大。

其次是定量CV和蛋白丰度的对应关系，来看下各自表现，纵坐标CV，横坐标log10 蛋白定量值

B质谱7分钟

A质谱8分钟

A质谱14分钟

以及3物种的定量差异散点分布图和密度分布图

B质谱7分钟

A质谱8分钟

A质谱14分钟

由于上面的图的纵坐标不那么一致，我将3套数据的密度图纵坐标调成一致并叠加，从左到右依次是B7,A8,A14。可以清晰地看到B7优于A14优于A8。

可以发现，25年了，我们的定性、定量结果相对于23年又再上了一层楼，不过超高通量带来的定量精度损失依然肉眼可见，尤其是低丰度蛋白的定量准确性依然原地踏步（综合参考CV:蛋白定量强度图和定量Benchmark图），超短梯度依然不是我推荐的方案。

而如果同时考虑定量SD，<10%和<20%可用蛋白的数量，大致定量表现为A14>B7>A8。如果考虑性价比及可用CV定量蛋白比例，则是B7>A14>A8

因为总的实验设计并不严谨，因此我们不能说哪个质谱更好，哪个梯度更差，不过总的来说，延长梯度可以有效提升定量可靠性，本测试仅提供一个考察思路，我们孜孜不倦的追求定量可靠性带来的一定是更多的新发现。

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