3000个run的DIA定量，你准备好了么？

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兵马未动粮草先行，想来阅读了我们往期推文以及各位大牛的新鲜出炉的各种DIA定量文献，各位是不是都在摩拳擦掌准备大展拳脚了呢？

近期我们某客户在3000个样品30万precursor谱图库规模的数据分析上遇到了些小困难，我想了想，也许大家都有这个疑虑呢？那我就来为大家实践下Spectronaut分析近3000例组织样品DIA数据的体验，愿大家数据分析都一切顺利。

素材准备

质谱数据

拷贝到本地硬盘。建议采用HTRMS converter转换储存，空间占用会小很多。共占用1.5TB左右空间。

搜库硬件

能否顺利处理有以下因素影响

a. 磁盘空间：
除了质谱数据本身占用空间外，软件计算时用到TEMP文件夹即软件缓存目录所在磁盘空间需要留足。软件缓存目录至少准备和RAW文件大小相当的剩余空间，建议使用SSD（sata即可），如果单个SSD空间不够，可以使用多个SSD创建动态磁盘后新建跨区卷（自行百度操作方法）。譬如本次分析，我们使用了2块 WD 4TB蓝屏SSD构建跨区卷得到7.3TB的空间，并最终使用了3TB的实际空间用于计算（1TB为结果SNE文件）。

b. 内存：
内存占用计算公式如下：

CPU并无特殊要求，你用10年前的CPU也可以运行，只是计算时间可能就遥遥无期了，而对于DIA计算来说，其中既有单核运算也有多核并发运算，Spectronaut软件支持单机任意核心数量并发计算，因此现有CPU的方案就当仁不让的采用AMD EPYC2 ROME 7742 64核双路平台，共计256线程。同时该U的主频也不算太低，睿频可到3.3GHz左右，让实现单线程步骤计算不会特别慢。当然您的实验室里如果只有Xeon Gold或Platinum也一样，保证内存、磁盘空间，CPU会使得分析速度略慢，但不会有关键影响。

d. 操作系统：

windows10 Pro/Server系统均可。不建议过于老旧的操作系统版本。

小结：

其他部件并无特殊需要，因此我们准备了一台双路AMD EPYC2 7742 CPU，1TB 内存，1TB nvmeSSD系统盘，8TB SATA SSD缓存以及16TB HDD数据存储盘。总预算不到10万即可大展拳脚了。

软件：

Spectronaut就不用过多介绍了，我司客户或者关注我们公众号的应该都非常了解了，记得运行时确保最新版本即可。所有参数均采用Biognosys已为您优化的默认参数即可，仅需要把temp文件夹指定到我们的8TB SSD即可。

FASTA:

本次测试对象为人，故参考近期推文即可：Uniprot中如何选择fasta？我只能帮到你这里了

建库：

建库步骤相当简单，分级DDA的RAW，用Spectronaut进行检索建库即可。耗时不到2小时，得到约30万个Precusor的谱图库，蛋白数量在此不重要，precursor数量是检索速度的主要影响因素。

DIA分析：

Add file from folder选中DIA数据所在目录，导入所有文件，选中库文件，finish；

分析时长：

包括原始数据导入，谱峰提取，检索，机器学习，蛋白组装，FDR质控，LC/MS质控，结果生成，平均每个文件4分钟，共耗时186小时。

见下图

大批量样品稳定性质控

就分析本身来说，除了时间略长，硬件消耗略大，其他其实没有特别之处。我们主要来考察下更换了多个色谱柱并清洗多次的质谱结果一致性如何。

iRT稳定性
个别异常，大部分稳定

定量数据点一致性

基本稳定在5DPPP上下，符合预期，个别异常值需要抛弃

我们没有参考其他文献采用经常性插入Hela标品进行质控的策略，而是直接对所有检测对象进行质控，更加直观、可靠。可以看出，以上QC图表的异常值指标对应性较好，均能指示特定样品出现异常，需要排查原因或直接抛弃。

其他细节内容因涉及客户数据，不详细展开，我们将在下次推文中为您详细解读。

总的来说，海量DIA定量数据分析本身并无非常高的门槛，稍高配置计算机+Spectronaut便能轻松胜任。其难点还是主要在更进一步的定量矫正和分析上。欢迎大家关注我们，我们会在后续推文中进一步更新相关内容。