Adv Sci｜2024完美收官：易算自动化方案助力人脑肿瘤多维度蛋白组图谱构建

2024年收官之际，易算生物再传捷报！来自上海交通大学转化医学研究院的刘晓慧和钱昆，来自瑞金医院神经外科的卞留贯主任和孙昱皓，以及来自复旦大学生物医学研究院的申华莉团队，联合易算生物，在Advanced Science上发表了最新的研究成果。文章基于质谱蛋白质组学找到了继发性人脑转移瘤（BrM）和原发性胶质瘤（Glioma）之间不同的激活通路及其蛋白标志物。

该文关键亮点：多维度、全景观、大规模的人脑肿瘤蛋白质组分析

大队列样本制备方案：

• 149例组织样本的蛋白组+磷酸化蛋白组：采用易肽Auto100工作站，易肽微量蛋白+磷酸化试剂盒。

• 144例血浆样本的蛋白组：采用易肽Auto100工作站，易肽快速前处理试剂盒。

• 20例血浆样本的糖基化蛋白组：易肽糖肽富集试剂盒。

样本制备是采用刘晓慧老师和易算生物开发的微量蛋白组-磷酸组分析管线，该管线与易肽Auto100 自动化样品制备平台和易肽磷酸化试剂盒耦联，可实现高通量96孔板的快速处理。具体流程如下：每个样本仅需≤100μg蛋白用于酶解，酶解后的肽段用易肽除盐Tip进行除盐，然后取20%纯化肽用于蛋白质组分析，另外80%纯化肽用易肽富集Tip进行磷酸肽富集。

在2024年下半年，易算更是将Auto100升级为Auto150，提供更可靠、更强大的自动化性能助力蛋白质组学极速狂飙。

• 快速微量磷酸化蛋白组技术——鼠脑空间蛋白组及磷酸组的联合分析

• 蛋白质组自动化进行到底，易肽Auto150焕新升级

• EasyPept-PTM磷酸化富集试剂盒
  

• EasyPept 肽段除盐和富集Tip

• Auto150焕新升级
  

• 分析 93 个标准样品（10 μg小鼠肺蛋白）的蛋白组，以确保平台性能和稳定。

• 在组织样本蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析中，用商业HeLa酶解肽作为质谱QC样本（ n=24），评估质谱稳定性。

• 此外还用HeLa细胞（ n=24）作为组织样本实验对照，以确保实验可靠。

• 该实验将肿瘤组织随机分为 4 个批次进行样品预处理和 LC-MS/MS 分析，因此在数据分析时，分别做基于批次和实际分组的样本聚类，以评估批次效应。

以上这些质控分析内容，均在易算EasyDIA中完成：

• EasyDIA (omicsolution.com)

下图是文章中引用了易算参与的样本制备细节，文章多处引用易肽试剂盒和Auto100自动化工作站的详细描述。

最终在严格的质量控制下：

• 蛋白组：对149例个癌和癌旁组织总定量12808个蛋白质，其中48.13%蛋白被磷酸化。

• 磷酸化蛋白组：对120例过滤样本总定量23802条磷酸肽，其中61.05%磷酸肽在蛋白质组学数据中被同时定量。

蛋白/磷酸化鉴定总体情况

1. 脑肿瘤共性挖掘分析（组织蛋白组+磷酸化）

对BrM/BrM-NAT和glioma/glioma-NAT的差异蛋白和差异磷酸化位点绘制了九象限图，发现两个关键蛋白 NOP2 和 INA在两种脑瘤类型中显示出一致的变化。

• NOP2:甲基转移酶NSUN家族中结构域的成员，促进肿瘤的增殖和侵袭。

• INA:神经元中间丝，某些肿瘤中表达降低。

文章进一步对差异表达趋势一致的失调蛋白质和磷酸化位点构建了相互作用网络，生成了六个显著富集的功能富集网络。值得强调的发现是：

• 功能富集网络中超过50%的蛋白为磷酸化水平的改变；

• 神经丝蛋白(NEFL和NEFM)，通常与INA协同作用，均表现出下调趋势，提示其可能参与了脑肿瘤的发展。

2. 脑肿瘤特异性挖掘分析（组织蛋白组+磷酸化）

对BrM vs Glioma的差异蛋白/磷酸化位点进行通路富集分析，并对这些蛋白进行药靶注释，得到一些关键结果：

• 著名的P13K-Akt信号通路的上游通路，在转移瘤和胶质瘤中失调状况不同，提示了不同肿瘤类型的疾病机制不同。 

• BrM作为脑转移瘤，其蛋白表达失调主要在黏着斑通路；

• Glioma作为颅内原发性肿瘤，表现出复杂的机制并影响多条通路；

• 靶向MAPK1的药物Neflamapimod和靶向EGFR的药物Osimertinib可以通过血脑屏障（BBB）。

磷酸化、通路与潜在药物（小药丸表示drugbank 中的药物靶点蛋白）

接下来对BrM vs Glioma的显著变化的磷酸化位点绘制激酶-底物网络，得到一些关键结果，为颅内肿瘤的药物筛选提供信息参考：

• PRKCE、RAF1和CSNK1A1激酶在BrM中被激活；

• CAMK2G、GSK3A、GSK3B、MAPK8和MAP4K6激酶在Glioma中被激活；

• 靶向RAF1的药物Sorafenib可以穿过BBB，经过文献调研，该药物已被证明可以预防晚期肾癌（RCC）向脑部转移（Ann. Oncol. 2010, 21, 1027）。

  
  

3. 多维蛋白质组图谱全景构建（组织+血浆;蛋白+磷酸化+糖基化;DIA+TMT）

筛选所有多维数据的差异信息，并通过可视化热图呈现结果。共筛选到55种共失调蛋白，26个差异磷酸位点，15个差异糖肽，比较组涉及BrM/BrM-NAT; BrM/NC; BrM/Glioma; Glioma/Glioma-NAT; Glioma/NC。

进一步对组织和血浆的共失调蛋白进行互作网络分析，得到一些关键结果：

• 组织和血浆水平再次证明了这两种肿瘤中PI3K-Akt signaling pathway通路被上游黏着斑通路的不同蛋白激活;

• 不同肿瘤存在肿瘤特征差异磷酸化及糖基化修饰，为后续的机制和marker研究提供更多参考信息。

4. 全面筛选血浆标志物

标志物筛选策略参考之前发表的文章思路：

• EMBO Mol Med复旦-易算最新临床蛋白质组成果 | 准确率90% |利用蛋白分子标志物 + 机器学习对患者风险分层
  

• View｜易算高通量、自动化、机器学习方案助力大规模样本标志物筛查

首先构建一个候选标志物库，该库由组织和血浆样本的差异分析、先前报道的生物标志物和临床报告中的 IHC 生物标志物组成。然后基于先前开发的 DeepPRM 方法，从 3261 种转移瘤和胶质瘤候选生物标志物中筛选到 110 种蛋白/肽，用于PRM分析。最终，建立了一个机器学习模型来筛选血浆生物标志物。

关键结果如下：筛选出3组标志物组合，分别区分BrM的癌和癌旁、Glioma的癌和癌旁以及BrM和Glioma，这些标志物组合以无偏椅的方式选出，非常具有优势。

到这里，对该文章实验和分析思路解读结束。文章的关键亮点在于构建了多维度全景式的蛋白质组图谱，包括癌和癌旁组织的蛋白组和磷酸组，患者和健康人血浆样本的蛋白组和糖基化组，对这些数据的分析发现了肿瘤特异性的分子病理机制，后续对血浆无创标志物的靶向验证，成功筛选到了癌变/分型生物标志物。

易算支持

本文第一作者为杨爽博士，郑永涛主治医师和周诚斌博士，本文中使用的高通量自动化样本前处理设备和试剂盒、质控标品，软件分析均由易算生物提供支持和服务。易算生物CEO沈诚频博士作为本文作者，为所有高通量蛋白质组学提供了全程保驾护航。

关于质谱蛋白组，从前处理到数据分析，易算有一套完整、快速且深度的解决方案。如果你也有相关课题，欢迎联系我们。