Blood最新封面 | 解读+思维导图 | 单细胞及多组学揭示补体C1Q促进急性骨髓性白血病（AML）的髓外浸润（EMI）和复发

文章题目：C1Q labels a highly aggressive macrophage-like leukemia population indicating extramedullary infiltration and relapse（文末链接原文）

分析样本：AML患者病例（含纵向收集） + 健康人群 + 细胞系 + 公共数据库 + PDX模型 + CDX模型

涉及组学：单细胞RNA测序 + 外显子测序 + 蛋白组学 + RNA-seq

组学下游：细胞迁移与侵袭实验、流式细胞仪、shRNA-knockdown、CRISPR–Cas9 knockout (KO)等

借鉴意义：单细胞及多组学实验如何对治疗与预后提供依据

1、 思维导图展示文献脉络

这个研究来自于一例复发的AML病例（患者编号：P-S1022）。鉴于传统疗法的失败和缺乏替代性治疗方案，预计以单细胞RNA测序（scRNA-seq）为研究起点，可能会为该患者提供个性化手段，找到可能的靶向治疗药物。这篇文章最终建立了一个信号传递的机制模型，以理解白血病细胞迁移的驱动因素。

研究是怎么往下推进的？易算团队制作了思维导图来演示结论产出的步骤，欢迎电脑保存。

文章的多个结果共同组成的重要性的结论，我们称为“里程碑事件”，是课题可以执行下一个阶段的重要标志。这个事件需要依赖多个组学、功能实验做上下游结合，且涉及了多组比较，关键样本还做了多个组学的实验以及和其他样本放一起被分到了组别中。

把零散的点连成线，末端是里程碑，开端是实验样本以及方法，理解文章更清晰。即使你大概率不做该疾病模型的研究，也可以借鉴这一篇文章的方法系统。

2、 文章要点

疾病背景：髓外浸润(EMI)，是AML这种血液恶性疾病的伴随症状，通常表现为肿块、结节或者斑块。既往队列研究报告，EMI的预后影响相互矛盾，有的研究认为EMI预后差，可能预示着急性髓性白血病（AML）的不良结局。但是有的研究经多变量分析调整后，没有发现诊断时的EMI对预后的影响。由于缺乏对EMI的充分了解，在临床上进行及时的治疗仍然是一个挑战。

这例复发的AML病例（编号：P-S1022）鉴于传统疗法的失败和缺乏替代性治疗方案，预计单细胞RNA测序（scRNA-seq）可能会为该患者找到可能的靶向治疗药物。

很遗憾疾病进展迅速，这名患者无法及时确定临床上的靶标就离开了，但通过这个病人收集到的样本找到了标志物， 研究可以继续往下走。

研究及时收集了BM（骨髓）和EMI（以皮肤为代表的髓外浸润）样本， 利用scRNA-seq先确定了补体C1Q+巨噬细胞样亚群。发现该细胞在EMI--皮肤中富集，在非常早期早已存在。

顺便提一句：为什么亚群叫补体C1Q+巨噬细胞样白血病亚群？因为单细胞聚类划分了集群以后，进一步检查了每个集群的特色基因，观察到巨噬细胞表达了高表达的成熟巨噬细胞标志物，包括C1QA、C1QB、C1QC、FCGR3A（CD16）和MAFB等。

C1Q是类似胶原蛋白的糖蛋白，是补体C1成分的识别单元。C1Q与适当的目标结合，导致补体成分的顺序激活和裂解，这在先天免疫中起着基本作用。由于C1Q基因表达的独特特征，因此将这个集群命名为C1Q+ macroblast。

问题来了，C1Q与EMI之间是否相关？

答案是肯定的。除了在这名复发的AML病例（编号：P-S1022）身上发现与健康捐赠者相比，表达了高水平的C1Q以外，在一个更大的AML人群以及有公开队列数据上证实，与无EMI相比，患有EMI的AML表达了更高水平的C1Q，且根据公开队列的生存资料发现，C1Q是AML的一个不良预后标志物。

但是在对C1Q表达趋势调研的过程中，也发现了一些看似不合理的现象。

为了搞清AML患者的C1Q表达特征，文章收集了AML早期阶段以及健康人群的百来个样本，富集到CD34+细胞，进行了RNA-seq和质谱定量蛋白质组学分析。

这时候遇到了意外。

根据前面的结果，很多人可能像我一样，会觉得C1Q作为预后标志物，在本轮差异比较（VS健康人群），在AML患者毫无悬念是高表达。很意外，无论是转录组还是蛋白定量，都显示了AML患者的C1Q表达水平较低。

此外，根据公共TCGA数据库的结果，与其他类型的癌症相比，AML的C1Q表达水平竟然也较低。

难道C1Q与白血病之间的关系到这里就草草结束了么？未必。

之前结果是不分AML亚型的。再看分AML亚型，发现M4和M5这两个亚型， 在BeatAML和Leucegene这两个数据库中显示出最高的C1Q表达水平，换句话说，C1Q表达水平在“M1，M2, M3”这一扒，和“M4,M5”这一扒之间有差异。我们一直提到的做了各种组学的这个AML患者，就属于M5这个亚型。

所以对于C1Q，既然早期人群比健康人群表达更低，晚期患者比健康人表达高，不同亚型、不同癌种之间表达有波动，这些看似矛盾的结果促使研究团队怀疑C1Q可能在疾病的发展过程中受到调节。

矛盾也是好事。

回到这名复发的AML病例（编号：P-S1022）身上。根据纵向收集（原发，第一次复发，第二次复发）发现，C1Q表达随着复发而增加。RNA-seq和定量蛋白质组学分析显示补体途径的富集。

再去调研其他的几名纵向AML患者，早发期（P-Z0119，造血干细胞移植后早期复发）或复发期（P-S1022和P-L2021）表达高C1Q的患者，在造血干细胞移植后早期复发或耐药。

再结合早发患者（P-Z0119）和我们一直提到的这个晚期复发患者（P-S1022），二人单细胞测序结果一起比较，发现C1Q+ 巨噬细胞样亚群同样也出现在该患者样本里，且有5个marker基因与P-S1022的C1Q+ 巨噬细胞相同且差异排名靠前。上述结果都指向了C1Q高表达和AML早期复发有关。

再往后走就顺利多了。

进一步，将C1q白血病细胞移植到免疫缺陷小鼠体内的病人来源异种移植（PDX）证实了这些细胞形成髓外病变：小鼠迅速死于白血病，而且表现出EMI的表型特征。

既然C1Q与EMI之间相关而且C1Q是AML的不良预后标志物，接下来就需要深入了解C1Q促进白血病的机制。

研究对人类白血病细胞系的C1Q+ 和C1Q– 细胞进行了分类，发现尽管C1Q+的那一组白血病细胞尽管没有显示出对化疗药物较低的敏感性，但有更大的迁移和粘附到基质的能力。

这意味着靠亲兵还是有外援？

有外援。

这个文章提示了白血病中成纤维细胞作用。文章在找到“C1Q+细胞有更大的迁移能力”这个突破口以后在接下来研究发现，这些细胞通过与成纤维细胞的相互作用和转化生长因子-β（TGF-β）的分泌得到刺激，通过C1Q-gC1QR信号轴与组织成纤维细胞完成沟通， C1Q靶向治疗有可能阻断EMI进展。

除了靶向治疗，本研究在化疗耐药机制方面也有自己的洞察。

BeatAML数据库的分析表明，C1Q的高表达与化疗的难治性相关，推测髓外组织可能有助于白血病在化疗压力下的生存。C1Q高表达白血病细胞与成纤维细胞共培养且进行了RNA-seq，以分析可能有助于化疗耐药的途径。

根据差异表达基因，GO富集分析表明，TGF-β受体信号的富集。而且值得注意的是，观察到与治疗耐药相关的多种途径；另一方面，皮肤成纤维细胞也经历了显著的转录重编程，细胞外基质合成途径富集，这意味着增加了细胞外基质的分泌。

再加上从白血病细胞获得的公开的转录组数据来看，发现化疗耐药细胞中上调的基因在C1Q补体途径中表现出显著富集，这些证据都指向C1Q的高表达有利于化疗耐药。细胞间的通讯导致了癌细胞和成纤维细胞的重新编程，以形成适应白血病的微环境。

3、 带来启发

1、单细胞测序是热点也是本文的起点，但蛋白组和RNA-Seq的对患者样本的全局无偏定量亦不可忽视。尽管这个复发的AML病例（编号：P-S1022）有疾病特殊性，且通过单细胞测序找到了C1Q+巨噬细胞样亚群作为切入点，但由C1Q+驱动的下游事件并不特殊。以全局无偏定量作为纽带，对检验的基因/蛋白数量、纳入的人群、相对排序的统计检验会更有意义。深入了解信号通路的动态变化尤其是在肿瘤异质性这类复杂的研究作为背景，可以帮助寻找未被发现的信号转导的分子耐药机制。

2、研究对象看似矛盾甚至反常的结果，往往因为收集数据的亚型、病程发展的阶段、分组所造成。也就是说，随着亚型的细分、病程的划分、分组的划分，结果可能会产生变化。这种变化不一定意味着实验做错了或者样本不够或者阈值不对，也可能指引你有新发现。比如C1Q表达出现看似矛盾的结果，促使研究团队怀疑C1Q可能在疾病的发展过程中受到调节，继而启发了后续研究。假如所有预判都顺理成章反而意思不大。

3、文章的最后，皮肤细胞有能力重建系统性AML，早发现、早根除组织驻留的EMI细胞对长期控制疾病非常重要。通过本项研究，能够识别具有EMI风险和潜在早期临床干预的患者分层。

本文由上海交通大学医学院附属新华医院卢莹、大连医科大学附属第二医院闫金松与上海交通大学基础医学院夏立合作完成。

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