Cancer Discovery文献解读 | 如何用微量的方法，识别三阴性乳腺癌化疗耐药以及敏感相关的生物标志物

一、Microscaled proteogenomics背景：活检样本做多组学

一直以来，尽管很多人用活检样本做蛋白组、或者基因组等单组学项目很容易，但是想使用活检标本进行蛋白质基因组学特征分析的挑战。

我给你做这个比较：临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC）要求至少100毫克的肿瘤组织，这样就尴尬了。

因为，对于临床诊断来说，一次快速冷冻的富含肿瘤的针吸活检（∼<20毫克），这么点必须提供足够的DNA、RNA和蛋白质，才能来进行深度的多组学分析。

对蛋白质和基因变化的联合分析需要太多的组织。而利用了Microscaled proteogenomics这种微量方法，可以让蛋白基因组学的大规模研究对上样的要求不成为瓶颈因素，比如每个样品只需要25μg的肽来同时表征蛋白组和磷酸化。每家单位在做微量项目的时候都有自己拿手的技术路线，那么这里采用了什么技术？

以最开始进行的乳腺癌患者为例。2020年研究，提到乳腺癌患者做了针吸活检，为了微观地处理标本，将最佳切割温度（OCT）--包埋的活检样本连续切片，将 50 μm 切片交替转到3个不同的 1.5 ml管中。每管装有6片，以此获得1）变性蛋白和DNA；2）RNA；3）天然蛋白和DNA的蛋白基因组实验策略，要解决的问题是识别对HER2靶向治疗疗效有关的标志物。

（Nat Commun. 2020 Jan 27;11(1):532. doi: 10.1038/s41467-020-14381-2.）

结果显示，治疗以后的患者经评估， 分为缓解的和未缓解的。缓解组其肿瘤样本中，HER2蛋白磷酸化在HER2靶向治疗后有所减少，未缓解组的肿瘤样本中的HER2蛋白磷酸化并没有减少，可能需要其他治疗手段来解决。寻找合适的生物标志物来筛 选对治疗高应答的患者，方能给患者最大的益处。这种方法将临床蛋白质基因组学方法的潜力带到了精准肿瘤学临床试验环境中，对诊断为乳腺癌的患者进行分层，并确定适当的系统性治疗。

二、新辅助治疗场景

转眼这个Microscaled proteogenomics技术到了2022年，面对肿瘤又有哪些新的应用场景呢？答案是新辅助治疗。

往往是安排在手术之前的化疗。这么安排有一个预期：

有的患者适合手术，那么做新辅助治疗会理论上有效减小肿瘤大小、杀灭更小的看不见的转移细胞，以利于后续的手术治疗。化疗后达到病理完全缓解（pCR）是目标。

但是这种方法，有的人效果很好，然而有的人肿瘤不仅没有变小，而且因为这个治疗时间是术前，它会推迟手术治疗的时间，还会导致肿瘤进一步扩散，因此这部分人疗效差。因此，明确某某药物的新辅助治疗的获益人群，确定合适的治疗方案和该疗法的疗效进行预测，就是要解决的问题。

三、用Microscaled proteogenomics技术解锁三阴性乳腺癌（TNBC）的新辅助治疗的与pCR相关的生物标记物

场景仍然放在乳腺癌上。三阴性乳腺癌（TNBC）的新辅助治疗， 其临床药物实验有两个特点：缺乏有效的疗效标志物；涉及到的不同的药物有七个。有些药物，对一部分患者可以道到病理完全缓解（pCR），然而对于另一批人就会收效甚微。所以，与pCR相关的生物标记物是研究的目标，有了这个标志物，能识别出来哪些患者需要使用研究性药物，而不是接受无效的标准治疗。在这个项目中，多个独立的数据集被用来验证发现的结果，包括其他TNBC临床试验的mRNA谱、免疫组织化学（IHC）、患者来源的TNBC异种移植（PDX）的临床前治疗研究和使用癌症基因组图谱（TCGA）数据分析。

• 痛点：non-pCR患者长期暴露在无效而且有副作用的治疗中，不能很快接受替代治疗；此外，PD-L1 IHC检测未能很好预测TNBC中免疫检查点抑制剂的获益人群，因此需要有新的可替代的标志物

• 患者：临床2期或3期TNBC患者

• 药物：治疗前和治疗后（六个周期的新辅助卡铂和多西他赛联合化疗（NCT02547987和NCT02124902））

• 目标：pCR（病理完全缓解）相关的生物标记物

• 患者分组：pCR(N=22) VS  non-pCR(N=37)

  
  

（原文图1：TNBC患者样本概览）

作者有三处洞见。

首先，蛋白基因组学特征，提供了更广泛的免疫微环境信息，可用于补充，PD-L1 IHC（免疫组化）检测。尽管基于TMT的PD-L1 蛋白组学检测不切实际，但是使用了重同位素标记对多种免疫反应相关分子进行优化检测的靶向蛋白组学检测是一种高效而且低成本的方法，可以对IHC补充。

（原文图2：TNBC肿瘤中与pCR相关的蛋白质基因组学特征，比如与免疫微环境相关的蛋白质基因组特征在pCR肿瘤中相对于非pCR肿瘤而言是升高的；DE散点图显示PDL1 IHC水平与PDL1蛋白（D）和磷蛋白水平（E）之间的相关性）

除了上面的第一个洞见以外，紧接着是第二个洞见。对治疗前患者活检的蛋白质组分析，揭示了一些代谢途径，包括氧化磷酸化、脂肪生成和脂肪酸代谢，这些途径与TNBC化疗耐药性有关。 而且，蛋白质组学和转录组学显示，敏感性的标志是DNA修复、E2F靶标、G2M检查点、干扰素信号和免疫检查点成分的升高。

这里插一句。对于TNBC的化疗，目前已有或者正在做实验的有哪些替代的疗法？有三类。

分别是使用质子泵抑制剂（PPI）奥美拉唑对TNBC患者进行脂肪酸合成酶抑制；另一种可能性是针对促肿瘤巨噬细胞的免疫抑制剂；第三类潜在的pCR预测因子是G2M检查点组件、E2F调节因子和MYC靶向通路。例如，具有高/完整Rb蛋白和磷酸化水平的TNBC肿瘤的pCR率较低，增殖和E2F靶基因表达水平也低于Rb蛋白丢失的肿瘤。因此，CDK4/6或CDK2抑制剂可能是治疗完整Rb的TNBC的一种替代方法。

最后是第三个洞见。蛋白质组学分析显然有助于找到新的化合物，尤其是在这里，拷贝数改变的蛋白质基因组分析揭示了新的化疗疗效标志物。

比如这篇以LIG1作为TNBC化疗耐药和多癌型不良预后标志物的鉴定为例。LIG1编码了一种连接酶，负责堵住DNA损伤反应中DNA的缺口。LIG1缺失被认为是卡铂耐药性的选择性生物标志物。

然而，在TNBC的背景下，这个认识可以继续拓宽。因为在本研究中观察到的单拷贝LIG1缺失可能不会产生足够的功能缺陷来产生耐药表型。更加想说明的是，发现的与抗性相关的19q13.31-33缺失， LIG1、POLD1和XRCC1位于该处，这三个基因都为滞后链（与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5ˊ-3ˊ聚合合成的新的DNA链）的合成服务。XRCC1特别值得注意，因为LIG3/XRCC1为LIG1在DNA修复和滞后链DNA合成过程中介导的DNA连接提供了一条旁路途径。

HRD（同源重组缺陷，BRCA1/2 基因胚系突变是导致乳腺癌HRD最常见的原因）和LIG1缺失是TNBC发病机制的正交方式,这有可能解释与化疗药卡铂不敏感的相关性。而且PDX研究（图6）也验证了这一点，因为来自治疗前样本的模型（WHIM68）有一个BRCA2突变，没有LIG1缺失，而随后的卡铂耐药系（WHIM74和75）已经失去了BRCA2突变，获得了LIG1的 hemizygous 缺失。

（图6 LIG1与PDX模型：LIG1、POLD1和XRCC1在三个PDX模型中的蛋白质基因组学状况，这些模型来自于同一TNBC患者在任何治疗前（WHIM68）、完成5个月的新辅助卡铂和多西他赛后的手术时（WHIM74）以及治疗开始后一年的肝转移灶（WHIM75）的纵向活检。突变和拷贝数数据来自WES，RNA来自RNAseq，蛋白质数据来自本研究产生的TMT蛋白组学。底部面板显示来自3个生物重复的LIG1、POLD1和XRCC1蛋白水平的Western印迹。GAPDH被用来作为对照。B）在三个PDX模型中测量肿瘤体积。黑线和红线表示分别用对照和卡铂治疗的PDX的肿瘤体积变化。C) Boxplots显示TNBCs PDXs中LIG1 mRNA水平，分为完全缓解（CR）组和非CR组。D)从BCaPE数据库中获得的患者来源的异种器官（PDXO）的LIG1拷贝数丢失与治疗反应之间的关系。）

总之，这项工作利用Microscaled proteogenomics方法，面向肿瘤治疗耐药机制，找到了与pCR相关的生物标志物，从而更好的识别出对某项治疗获益程度更好的人群，或者匹配更合适的人群到临床实验中去，将精准治疗落到实处。

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