很多人从不抽烟，但是还是会得肺癌。大多数研究肺癌的队列都纳入了吸烟人群，不吸烟人群又有哪些独特的特征？ 这篇文章来自cell，去年发表。文章很长，而对蛋白质组学数据解读要看结果六和结果七。
上一篇我们说了结果六。蛋白质组学的角度，将肺癌人群分为三个亚型。
亚型1包括最大的群体，特征是：代表晚期肿瘤（分期超过II）、有内脏胸膜侵犯的肿瘤、TP53突变和最高的突变负荷；亚型2是一个较小的群体，由没有EGFR-L858R突变的早期患者（主要是IA和IB）组成；到了亚型3代表早期阶段（主要是IA阶段），无TP53突变。
今天我们说结果七--Protein Network Characterizationof Proteomic Subtypes Identify Candidate Biomarkers and Druggable Targets, 采用WGCNA分析。
WGCNA（Weighted correlation network analysis）你可能听说过。找过范例吗？这一篇文章的结果七，就是WGCNA的范例。
结果七提供了决定每个分子亚型的生物学特征的整体视角，而且还使潜在的药物靶点和生物标志物的选择更加合理。怎么做的呢？还是三步。分别是建网络、看网络特征、找靶点。
第一步：建WGCNA分析网络
用至少80%的腺癌患者中的9072个蛋白，其中心化-log2T/N值进行加权相关网络分析（WGCNA）（数值见原文表S7A，可点击阅读原文来找到这批数据）。
WGCNA分析步骤如下：
首先，选工具和输入数据。使用RStudio中的WGCNA（Langfelder和Horvath，2008）；使用的是至少80%的腺癌患者中量化的9072个蛋白质的中心化-log2T/N值。
然后，确认重要参数。根据无尺度拓扑模型拟合（R2=0.8），选择了power为5的软阈值。用 "cutreeDynamic "函数进行模块识别，使用 "树 "方法和minModuleSize=5。使用Perseus 1.6中的GOBP-slim、GOCC-slim、CORUM和KEGG术语，通过Fisher's exact检验进行模块的功能注释（Tyanova等，2016）。
最后，可视化以及网络修剪。蛋白网络在Cytoscape（Shannon等人，2003）中进行了可视化。为了简洁，研究者对网络进行了修剪，只保留了属于每个注释类别中富集最高的术语的蛋白，相关权重大于0.03的边（仅有正相关），源节点和靶节点的相互作用阈值为50。
根据WGCNA的结果， 研究者找到了279个模块，其中195个模块对基因GO、KEGG和CORUM（哺乳动物蛋白复合物的注释库）有明显富集（Fisher's exacttest, Benj. Hoch. FDR < 0.05, 表S7B，见阅读原文，下同）。
研究者应用过滤来修剪输入，构建了一个由3014个节点和44665条边组成的网络（图7A；表S7A）。
图7A：由3,014个节点和44,665条边组成的蛋白质相关网络。节点根据模块成员身份用颜色编码。代表性的富集生物术语显示为不同的模块。
经过上述的分析，网络做好了。在这个蛋白质组的网络中， 有什么特征?
得结合亚型才能找到最有价值的信息。
第二步： 结合亚型看蛋白网络特征
网络特征通过以下几个方面：相关性、子网络功能、免疫细胞分析。
首先我们来看相关性。所有边的平均Pearson相关性为0.63，28%是已知的STRING相互作用，得分>0.4。
值得注意的是，RNA水平上的相关性值很低（中位数为0.19），即使是找已知的关联也低至中位数仅为0.25（图7B）。
图7B：(A)网络中显示的相互作用的成对蛋白质-蛋白质和RNA-RNA相关性的密度图。
而且，图7C也显示了RNA与蛋白的相关性，从颜色的分布会发现整体相关性不高。
图7C: 网络节点上的RNA-蛋白质相关性的叠加。
接下来我们看子网络功能。
目光仍然放在蛋白网络上。 使用模块eigengenes，确定了29个较小的子网络，我们上一篇说过，蛋白质组学的一致性聚类将肺癌人群分为三个亚型。
而在这里， 将每个蛋白质组亚型的相对蛋白丰度叠加在网络上寻找功能差异， 你会发现在三种蛋白质组亚型之间，不同的调节模式如下（图S7A）：
从亚型3和2到亚型1（含晚期肿瘤），观察到蛋白酶体、细胞周期和内质网网络的富集逐渐增加。
亚型2具有独特的特征，过氧化物酶体、细胞连接、粘附、信号转导、氨基酰-tRNA生物合成、TRAPP复合体和染色质修饰网络的富集较高。
亚型3中，细胞因子介导的信号网络、纤毛膜、细胞粘附和细胞外基质组织、细胞连接和内吞作用富集较高。（图S7A中的网络17-21）。
图S7A：基于eigengene值的蛋白质组亚型之间具有不同调节的蛋白质网络（方差分析，FDR < 0.05）。
其中有两个子网络引起了他们注意：这两个子网络包括免疫细胞特异性蛋白，如转录因子IKZF1、IKZF3、NFATC1和NFATC2（图S7A中的网络25和26），并且在代表早期肿瘤的第3亚型中有较高的表达。
根据人类蛋白质组图数据库（图S7B），这两个模块都含有在B细胞、T细胞和自然杀伤（NK）细胞中高表达的蛋白（Kim等人，2014）。
图S7B：根据人类蛋白质组图数据库（https://www.humanproteomemap.org/），在网络#25和#26中发现的蛋白质的组织蛋白表达。
最后是免疫细胞分析。为了研究上面的观察结果，对所有组织的RNA-seq数据进行了CIBERSORT分析。结果发现， 肿瘤与NAT分离，大约一半的肿瘤中几种免疫细胞类型共存，有几个肿瘤呈现出低水平的免疫浸润（图S7C）。
图S7C：基于RNA-seq数据的CIBERSORT分析的免疫细胞剖析。热图显示了患者组织中Z-score转换后的绝对免疫细胞丰度。
蛋白网络和基于RNA的方法发现显著相关（图S7D），以此区分免疫细胞相关蛋白丰度高或低的患者（图S7E）。
图S7D-E ：(D) T、B、NK细胞的平均z-coreCIBERSORT结果与免疫相关网络#25和#26的平均eigengene值的相关性图。(E）免疫细胞相关蛋白谱的聚类图。临床信息按免疫力高和低的队列进行聚类。重要的临床特征通过Fisher's exact test进一步计算。
有趣的是，位于肺部右侧的原发肿瘤患者与位于左侧的患者相比，呈现出更高的免疫表达（P =0.0379）。“Antigen processing and presentation”（MHC II类）在亚型3中也较高（网络27）。这个结果提示，免疫浸润是否与病人的结果或对免疫疗法的反应相关，还可以继续研究。
接下来就是找靶点。
第三步：找靶点
鉴于肿瘤微环境（TME）在肿瘤发生和发展中的重要作用，研究者进一步使用ESTIMATE算法（Yoshihara等人，2013年），利用RNA-seq数据来解读肿瘤中基质细胞的贡献。
为了确定潜在的蛋白质生物标志物用于TME的免疫组化验证，将患者分为基质得分高和低的两组（<第一和>第三四分位数），并计算出不同的蛋白质表达（图S7G）。
在排名靠前的蛋白质中，CILP在高基质组的丰度高出2.6倍（方差分析，p = 0.00396，图S7H）。
CILP蛋白平均31个肽，并被映射到与细胞外基质组织相关的模块，代表了一个有希望的基质细胞靶点候选分子，可使用免疫组化或基于质谱的检测方法进一步开发。
图S7G -H：(G) 利用肿瘤和正常邻近组织的量化归一化RNA读数，将患者分为高和低两组的基质评分（<第一和>第三四分位）。(H）高基质组和低基质组的CILP蛋白的log2T/N值差异（倍数变化=2.6，方差分析，P = 0.00396）。
另一方面， 为了确定潜在的药物靶点，根据药物基因相互作用数据库中的已知抑制剂（图7F；表S7D），对网络上所有可药用的蛋白质进行了注释。
做完注释，确定了一个由65个上调蛋白组成的小型子网络（中位数log2T/N>0.5），其中包括几个基质金属蛋白酶（MMP2、MMP11、MMP12和MMP14，图7F；表S7E），表明对matrisome有重大调控。
图7F: 网络中具有已知药物抑制剂的蛋白质节点（来源：DGIdb）用橙色突出显示。中位数log2T/N>0.5的可药用蛋白质子网络被放大。
聚焦matrisome调控蛋白，发现基底膜和ECM附属蛋白大多下调，而ECM调节分子，包括MMPs和Cathepsins，上调（图7G）。这些发现可能反映了肿瘤微环境（TME）的调节，其中MMPs是关键角色（Naba等人，2012）。
图7G：带有蛋白质类型注释的顶级差异调节母体蛋白质的热图。
MMP7、MMP11和MMP12在亚型1的晚期和晚期类中表现出最明显的上调（图7H）。有报道将MMPs作为治疗靶点（Merchant等人，2017）。
图7H ：Boxplots说明了MMP2、MMP7、MMP11、MMP12和MMP14在不同精细分类中的丰度。中心线代表中位数，方框的边界代表第一和第三四分位数，上下须延伸到1.5×IQR内的最高或最小的值。
为了评估它们作为生物标志物可能性，在另一个有生存数据的117名早期患者的独立回顾性队列的肿瘤中，对选定的MMPs进行了免疫组化染色。结果显示，MMP11和MMP7的高表达与低生存率显著相关（图7I），提示其潜在的预后价值。
图7I：MMP11、MMP7和MMP2的免疫组织化学染色数据的Kaplan-Meier图。
再去看看这些分子的研究背景。MMP11以前被发现在NSCLC中高表达（Kettunen等，2004），而且最近被报道为一个关键的促肺癌基因（Yang等，2019）；然而，它在进展过程中的蛋白水平调节从未被探索过。
综上所述，研究者提出MMP11是一个有潜力作为NSCLC早期检测和治疗的生物标志物的候选，待在更大的队列中进一步验证。
总结
WGCNA蛋白质网络， 不仅提供了决定每个分子亚型的生物学特征的整体特征，而且还使潜在的药物靶点和生物标志物的选择更加合理。
几种免疫细胞类型在肿瘤样本中共存，免疫细胞丰度不一，基质金属蛋白酶（MMP）在肺癌进展中发挥重要作用。
利用一个独立的回顾性队列，提示基质金属蛋白酶（MMP）与疾病的结果有关。
总的来说，这项研究揭示了早期肺腺癌的分子结构和肿瘤进展的特征，对东亚人群的非吸烟肺癌管理有用。
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