Cell文章解读|肠癌研究再次突破，发现肿瘤状态转化和免疫相互作用的新模式

近日，一项新的研究突破了肠癌治疗的瓶颈，发现了肿瘤状态转化和免疫相互作用的新模式，这项研究发表在《cell》杂志上，引起空间组学领域的广泛关注。

文末有原文链接。

文章题目：Multiplexed 3D atlas of state transitions and immune interaction in colorectal cancer

期刊链接：Cell. 2023 Jan 19;186(2):363-381.e19. doi: 10.1016/j.cell.2022.12.028.

关键实验：单细胞测序、循环免疫荧光（CyCIF）、连续切片的三维重建

研究目的：组织成像、三维重建、空间统计和机器学习，来对人类结肠直肠癌样本进行高分辨率、高维度的分析，以便更好理解其生物学特性和病理学特征，包括组织和分子亚型、各种细胞类型的表型和功能，并探索它们之间的相互作用和调节机制。

1 样本策略

对于这项研究，研究人员用CyCIF技术对人类大肠癌样本进行了成像，并使用了不同的抗体来识别不同的细胞类型。

文章通过对93个样本进行了成像，其中对一个样本（CRC1）还进行了三维成像，与单细胞RNA测序和GeoMx转录组学分析结合；另外16个样本使用2D WSI，77个样本在TMA中分析。

MCMICRO软件分割了成像数据，并基于细胞表面标志物的表达，来分配细胞类型；使用t-SNE算法对这些细胞进行了分类，比如说可以清晰地将CK+上皮细胞（正常和转化的）、CD31+内皮细胞、desmin+间质细胞和CD45+免疫细胞进行分离。进一步将免疫细胞分类，同时用单细胞RNA测序，证明了图像数据对细胞类型丰度的鉴定准确性。

标本和实验概览

2、肿瘤内部异质性特征

肿瘤细胞中的蛋白质标记和组织形态往往是分级的，表现为跨越从细胞直径几个单位到数毫米的空间尺度的表型转变, 例如，表观遗传标记H3K27me3和H3K27ac的梯度可以跨越整个组织标本的数厘米。

细胞通常被组织成大的、相互连接的3D结构，这些结构包括1-4个细胞的肿瘤芽、在2D上被肿瘤包围但是由3D网络连接到肠道腔和肠道微生物群的肠粘液池，以及在抗肿瘤免疫中起重要作用的TLS。TLS指的是肿瘤相关淋巴组织（tumor-associated lymphoid structures，TLS），它是肿瘤微环境的一部分，包括B细胞、T细胞、树突状细胞和其他免疫细胞。TLS在肿瘤免疫治疗中起着重要作用，因为它们可以产生抗肿瘤免疫反应并促进肿瘤的免疫清除。

二维的小的、孤立的肿瘤和粘液蛋白结构在三维中是大的、连接的网络

TLS的网络

肿瘤异质性的形态差异与单个标记的差异不相关，而是涉及多种蛋白质组合的超高维特征。基于作者使用机器学习模型分析了高维度的蛋白质标记数据，发现肿瘤形态的差异不能通过单个蛋白质标记的水平来解释，而是需要考虑多个蛋白质标记之间的复杂相互作用。表明肿瘤形态的变化可能是由多种基础分子梯度的共同作用所导致的，这些梯度可能包括表观遗传调节因子、癌基因、细胞因子和营养物质。

3、肠癌浸润边缘的免疫学特征

发现肿瘤边缘的形态和浸润深度对患者预后有着很高的预测价值。该文发现肿瘤内免疫环境可以在单个肿瘤内大量变化，并在样本间隔断性地发生变化，而肿瘤芽区(原文称作TB区域)是T细胞数量最多的区域，但也是免疫抑制最严重的区域（具有丰富的Treg和表达PDL1的细胞）。与此相反，深入浸润边缘的肿瘤细胞高度增殖，周围免疫细胞较少。

CRC的免疫状况及其侵袭范围

在17个结肠直肠癌的样本中，除了一个样本外，表达PDL1的髓样细胞数量比表达PDL1的肿瘤细胞多4倍或以上。高分辨率成像也显示出髓样细胞经常与PD1+ T细胞形成PDL1: PD1介导的接触，这些发现与近期在结肠癌小鼠模型中的数据一致，显示出树突状细胞是免疫抑制性PDL1的主要来源。所以这也拓宽了一个认知: PD1-PDL1相互作用主要发生在T细胞和髓样细胞之间，而不是在肿瘤细胞和免疫细胞之间。

靠近T细胞的PDL1+细胞的相对丰度在不同的肿瘤中有所不同，这表明树突状细胞并不是唯一相关的PDL1+髓样细胞种群。此外，虽然除CRC17外，表达PDL1的肿瘤细胞很少，但这些细胞在TB区域(即肿瘤发芽区域)集中，也可能发挥免疫抑制作用。

4、更多启发

4.1 三维结构：本文从对肿瘤异质性的研究开始，通过多重荧光染色技术对肿瘤细胞进行了高分辨率3D成像，发现了多种肿瘤特征的细胞形态学特征，如细胞核形态、核仁形态、细胞膜形态等。接着，研究者们观察到细胞的这些特征并不是孤立存在的，而是存在着相互连接的3D结构，这些结构可以是细胞膜的延伸、细胞质内的通道和结构等。研究者们认为这些结构可能与肿瘤的生长、转移和治疗反应等方面有关，因此对这些结构的认识具有重要意义。

4.2 在本文中，作者通过多个步骤来保证细胞定位、分类和注释的可靠性，包括：

首先，进行CyCIF前，先使用传统的光学显微镜和组织学方法来确定肿瘤区域和浸润边缘，并在该区域内选取多个感兴趣区域（ROI）进行CyCIF分析。

然后CyCIF分析：多种抗体来标记不同种类的蛋白质，并使用计算机算法将每个细胞分类到不同的类型中。同时，作者还使用了t-SNE算法来对单细胞数据进行降维和可视化，以帮助识别不同的细胞群体。

接下来单细胞测序：作者在对一些样本进行CyCIF分析后，还对同样的样本进行了单细胞测序，以进一步验证CyCIF分析结果的准确性，并确定细胞类型和相对位置。

确认和修正：在获得CyCIF和单细胞测序结果后，作者还使用传统的光学显微镜和组织学方法来验证和修正细胞分类和定位。例如，在确定一些细胞类型时，作者会通过对组织切片进行免疫组织化学染色来进一步确认这些细胞的特定蛋白表达情况和位置。

通过这些步骤，作者能够在高分辨率下对不同细胞类型进行精细的定位和分类，并确定它们在肿瘤组织中的相对位置，从而为后续的功能分析提供了有力的支持。