【Cell Rep】易算共一作：蛋白代谢+机器学习发现肝细胞癌治疗敏感分子

2024年2月27日，复旦生物医学研究院刘锋团队与复旦附属中山医院樊嘉院士团队黄成教授和孙惠川教授、南京大学余德才教授合作在Cell Reports上发表题为“Proteomic and metabolomic features in patients with HCC responding to lenvatinib and anti-PD1 therapy“的研究论文。该研究分析了来自肝细胞癌患者以及正常对照组的血浆样本的蛋白质组和代谢组。对于基线（治疗前）数据，通过机器学习建模以预测治疗敏感者。研究比较了敏感者和非敏感者、患者和对照以及治疗前后的关键差异分子和功能通路，这些分子能够预测生存期。总之，该研究确定了与uHCC联合治疗敏感者相关的血浆特征。在这篇文章中，李中晨、王颉、刘和斌（易算生物生信工程师）、郑懿民、黄建航为论文的共同第一作者。其中，易算生物刘和斌主要负责机器学习建模和生存分析，以及一致性聚类、ROC、Metascape和GSEA等分析的指导和参与。

技术路线

研究队列——主要队列：51 名不可切除肝细胞癌（uHCC） 患者治疗前后的67例血浆，包括26 例为敏感者和25名非敏感者，敏感者有26例治疗前和10 例治疗后血浆。非敏感者有25例治疗前和6例治疗后血浆；新队列：13 名 uHCC 患者治疗前血浆，包括8名敏感者和5名非敏感者；健康队列：15 名健康对照血浆；组织队列：40份患者治疗后肝癌组织样本，包括20名敏感者和20名非敏感者。

实验分析——对主要队列以及健康对照组的82例血浆样本进行了蛋白质组和代谢组分析。在建模分析和比较敏感者和非敏感者时使用的是治疗前的HCC样本（基线敏感者/非敏感者），在比较患者和对照、治疗前和治疗后时使用的是HCC（67例）。来自新队列的 13 个样本用于蛋白质印迹分析。对组织样本进行了全基因组突变测序、蛋白质印迹和蛋白质组学分析。

分析结果

一、患者分层特征

通过相关性矩阵（图A）和主成分分析（图B）显示，正常组和患者之间明显区分。从样本一致性聚类分析（Consensus cluster）图C发现，样本分为正常组和HCC组，确认疾病差异（正常/癌症）大于样本间异质性（敏感者/非敏感者）。在没有健康对照的情况下，HCC患者被分为两组，主要基于敏感性区分（图D），这表明个体差异（敏感者/非敏感者）大于治疗差异（治疗前/治疗后）。因此，血浆蛋白质组或代谢组的基线个体差异可用于对患者进行分类和做出临床决策。

健康对照和HCC患者血浆蛋白质组学分析，代谢组分析和结果与之类似

二、机器学习建模，预测敏感者与非敏感者 

接下来，建立逻辑回归（LR）机器学习模型，以预测敏感者和非敏感者。建立模型前需要对蛋白和代谢进行差异筛选，筛选的标准为双尾T检验并且进行B-H校正的p-adjust<0.05，同时代谢还要满足VIP>1的条件。将主要队列患者分成75%训练集和25%预测集，将训练集进行Log10处理、中心化和标准化，然后进行10折交叉验证的训练。该模型在主要队列中随机选择的39名训练队列中取得了良好的表现，实现了0.974的AUC（95% CI，0.933–1.000）（图A），并且在剩余的12名患者中得到了完美的分类（AUC = 1;95% CI，1.000–1.000）（图F）。此外，在关注 HCC 患者对抗 PD1 免疫疗法反应的外部代谢组学数据集中，对大多数患者进行正确预测(AUC为0.778（95%CI，0.526-1.000）)（图C），强调了该模型在预测HCC患者免疫治疗反应方面的潜力。有趣的是，代谢物-LR 模型在接受抗PD1免疫治疗的肾细胞癌（RCC）队列中表现出高预测能力，准确预测了70% 敏感者和72%非敏感者，AUC为0.769（95%CI，0.716-0.822）(图D)，表示模型的可推广性。它还表明，免疫疗法（联合疗法或单一疗法）的敏感者可能具有一些共同的血浆代谢组学特征，无论其癌症类型如何。

同样地，该研究建立的随机森林（RF）模型（tree=500,maximum iteration time=300）在训练和测试队列中也表现出显著鉴定能力。图E和图J分别展示了逻辑回归和随机森林模型中的潜在代谢产物，其中溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、可的松（Cortisone）和硬脂酰胺（Octadecanamide）（红色*号表示）同时应用在两种模型中。

根据 HCC 患者基线血浆代谢组特征，使用 LR 和 RF 模型将敏感者与非敏感者进行分类

三、比较敏感者vs非敏感者的基线蛋白组和代谢组特征

敏感者表现出 40种血浆蛋白的显著上调（图A），Metascape 通路和KEGG分析（图B）和基因集富集分析（图C：GSEA）发现，通路富集主要为补体级联通路，其中包括对触发、调节和形成最终补体MAC至关重要的蛋白质，包括C1QB，C4A，C8A，C8G等。此外，这些增加的补体蛋白与更好的总生存期（OS）或无进展生存期（PFS）相关（图E：生存分析-Kaplan-Meier curve）。因此，这些蛋白质水平的增加可能是HCC患者对联合治疗反应的阳性标志物。

非敏感者有15种蛋白质上调。这些蛋白质主要参与免疫球蛋白（Ig）的产生，表明肿瘤新抗原触发的潜在免疫应答。其中，IGKV2D-28 和 IGKV320倾向于预测 HCC 患者的不良预后。这些免疫球蛋白的增加是对联合治疗敏感性的阴性标志物。此外，在敏感者中下调的蛋白质中，FGA、APOA1 和 APOA2 与不良预后相关。这些减少的蛋白可能是对联合治疗敏感性的阴性指标。

敏感者和非敏感者之间的基线血浆蛋白差异

在基线血浆代谢组数据中筛选出29种差异代谢物。16种在敏感中上调，其中，11种为甘油磷脂（11/16），包括4种磷酸胆碱（PC）和7种溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）。研究发现 LysoPC（15：0）、LysoPC（16：0）和 LysoPC（16：1（9Z）/0：0 的增加与 HCC 患者更好的 OS或 PFS 相关。HCC 血浆中的 LysoPC 可能在先天免疫和抗 PD1 免疫治疗中发挥关键作用。Western blot分析表明，血浆中观察到的LysoPCs变化可归因于LPCAT1、ATX和PLA2表达水平的改变。结合以往报道，这些高水平的分子可能会增加癌细胞对联合治疗的脆弱性。

四、比较患者vs对照的血浆蛋白质组和代谢组差异

与正常对照组相比，HCC血浆中有63种蛋白质显著增加，95种蛋白质显著减少。功能富集分析显示，HCC血浆上调的蛋白质显示出更高水平的血小板活化和急性炎症反应，这是HCC和其他癌症类型发病机制的公认标志。

与正常对照组相比，HCC血浆中上调了16种代谢物，其中，磷鞘脂（1-磷酸鞘氨醇，SIP）和吡啶羧酸（1-甲基烟酰胺）在所有HCC组中均显示增加。S1P在许多癌症类型的癌变和发展中起着重要作用。1-甲基烟酰胺在肝细胞癌中增加，与肝功能恶化和预后恶化有关。这些代谢物的增加可能有助于HCC的癌变或发病机制。

HCC 和正常对照之间的血浆蛋白和代谢物差异

五、比较治疗前vs治疗后的血浆蛋白质组和代谢组的变化

联合治疗诱导代谢组学变化，特别是上调五种 LysoPC/PC。这些主要存在于敏感者的治疗后血浆中，并预测了 HCC 患者的良好结果，这表明高血浆水平的 LysoPC/PC 可能预示着 HCC 患者的良好反应。LysoPC/PCs主要在肝脏中合成。尽管肝功能障碍在晚期 HCC 中很常见，但研究结果表明，在治疗期间保留 LysoPC/PC 合成具有潜在益处。

六、比较敏感者vs非敏感者的癌症组织的蛋白质组学分析

研究对接受联合治疗的20名敏感者和20名非敏感者的癌症组织进行了蛋白质组学分析，确定了8995个蛋白质组，能够进一步研究与治疗反应相关的蛋白质组学变化。差异分析筛选到72种上调蛋白和53种下调蛋白。富集分析发现，敏感者中上调的蛋白质在肾病综合征和肥厚型心肌病等通路中富集，反映了联合治疗的副作用。此外，上调的蛋白质富集了脂质的代谢，有趣的是，靶向脂质代谢已成为增强肿瘤免疫治疗的极其重要的策略。尽管 84%（531种）的血浆蛋白与组织蛋白质组匹配，但在组织PCA分析中没有反映类似血浆中区分敏感者和非敏感者的差异蛋白。

总结

1. 蛋白组+代谢组联合分析：文章对肝细胞癌患者的血浆样本同时做了蛋白组和代谢组分析，通过生信分析筛选出了敏感者中具有高水平的血浆补体蛋白和 LysoPC，预示着良好的预后。

2. 基线数据机器学习建模：使用代谢组基线数据进行机器学习模型构建，成功预测了敏感者，并在外部队列中验证了模型准确性，这可能为HCC的诊断和治疗提供策略。

3. 多层面两两比较：比较基线敏感者和非敏感者以发现生物标志物，以期指导患者治疗；比较患者和对照以理解HCC发病机制；比较治疗前vs治疗后的差异分子以揭示对治疗积极反应的生物标志物；比较敏感者和非敏感者组织以研究治疗反应和副作用。

在这篇文章中，易算生物主要负责机器学习建模和生存分析，以及一致性聚类、ROC、Metascape和GSEA等分析的指导和参与。

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