来自：DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.08.023；这张图概括了三个层面的问题：做了什么实验、包含哪些分析、结果有什么用
1 亮点
-蛋白基因组学特征揭示了基因组改变的功能影响
-磷蛋白质组学发现了KRAS下游的潜在的治疗靶标
-多组学将内皮细胞重塑和糖酵解与免疫排斥联系起来
-蛋白质组学和糖蛋白质组学找到用于早期检测或干预的候选标志物
2 摘要
这是一篇多组学研究，文章在今年9月份发表在cell杂志。胰腺导管腺癌（PDAC）是一种高度侵袭性癌症，患者生存率低。为了解驱动PDAC致癌的潜在分子水平的改变，研究者对140例胰腺癌、67例正常邻近组织和9例正常胰腺导管组织进行了全面的多组学研究。
用了哪些组学手段？蛋白质组学、磷蛋白质组学和糖蛋白质组学分析被用来描述蛋白及其修饰的特征。此外，全基因组测序、全外显子组测序、甲基化、RNA测序（RNA-seq）和miRNA测序也在同一组织上进行，以进行综合分析，确定基因组改变对蛋白表达、信号通路和翻译后修饰的影响。
分析中遇到的难点是什么？肿瘤细胞占比（NeoplasticCellularity）是分析前质控的关键环节。为了确保下游分析可靠，使用分子特征的多种正交策略评估肿瘤的细胞占比，并通过基于组织学审查的肿瘤细胞性的病理学估计进行验证。
3 关键词
胰腺导管腺癌 蛋白基因组学 KRAS 肿瘤细胞占比 糖蛋白 激酶抑制剂 免疫冷肿瘤 内皮细胞肿瘤 亚型分析 CPTAC
4 简介
胰腺导管腺癌（PDAC）的治疗是一个难题。5年生存率低于10%，是最致命的实体恶性肿瘤之一，预计到2030年将成为癌症死亡的第二大原因。大多数患者（80%-85%）一旦确诊，已经到了局部晚期或远处转移的程度，且无法切除。化疗作为转移性PDAC的一线治疗，只对生存率有一定的改善，然而已经转移的患者取得的中位总生存期仍不到12个月。
在过去的十年里，人们对这个疾病做了一些功课。比如PDAC的关键基因（KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4）的体细胞变异的识别，以及基于基因表达模式的肿瘤分子分类。此外，靶向治疗也有一定进展。但靶向治疗仅适用于少数胰腺癌患者，而且在给予单一药物时可能出现耐药性。
为什么要开展这个研究？原因有三点：
首先，突变需要再去认识。体细胞KRAS激活点突变，是PDAC中最主要的基因改变。然而，除了G12C变异，KRAS其他变异没有都没有现成合适的靶向药。除了下游的细胞内变化外，人们越来越认识到KRAS突变对肿瘤微环境也有广泛的影响，会促进和维持癌症的恶性程度，影响到免疫疗法的疗效和药物输送。
其次，胰腺癌的免疫治疗获益人群需要精准筛选。由于大多数胰腺癌在免疫学上是出了名的 "冷"，因此需要分子分类器来识别那些可能受益于免疫疗法的相对 "热 "的癌症患者，并需要让其揭示驱动大多数PDACs免疫排斥的机制。
最后，基因组和转录组的局限性。尽管有基因组和转录组--这两套手段来确定PDAC中活跃的、可被靶向的关键信号通路，并已有人找到了开始揭示基质和免疫环境的重要性，但仅靠这些特征还不足以完全阐明这种癌症并支持精准肿瘤学的进步。
因此需要开展这个研究。
跟以往相比，会有什么新的内容呢？
首先，加入了蛋白质组学。整合了蛋白质组学和翻译后修饰（PTM）分析的蛋白基因组学方法，提供一个更全面的胰腺癌生物学视角，还能找到用于早期检测或干预的候选标志物。研究者对未接受治疗的PDACs、配对的正常邻近组织（NATs）和大块切除的正常胰腺管组织进行了全面的蛋白基因组学特征分析。
其次，解决了胰腺癌特有的低肿瘤细胞占比的问题。研究者重点关注由几种交叉验证方法定义的具有高肿瘤细胞性的肿瘤，并通过应用分子和组织学的反卷积，探索了肿瘤性导管上皮细胞特有的蛋白基因组学特征。使用从正常胰腺导管中分离出来的组织，使研究者能够克服正常胰腺实质的高 腺泡细胞含量，并直接比较肿瘤性导管上皮细胞和非肿瘤性导管上皮细胞，证实了使用PDACs和NATs确定的临床相关蛋白标记。
最后，这个结果可以给其他研究作为证据支持。综合蛋白基因组学特征揭示了基因组和表观遗传扰动对蛋白和蛋白修饰的表型影响，并划分了PDAC分子亚型和细胞微环境组成。这个多组学数据集构成了资源，能用于未来的研究，尤其是早期检测和基于肿瘤分类的病人分层以指导治疗选择这个方向。
5 结果
5.1 队列的多组学概貌
5.1.1 实验设计
收集了 140 个未经治疗的胰腺肿瘤（135 个 胰腺导管腺癌PDAC 和 5 个胰腺腺鳞癌）、67 个配对的正常邻近组织（NATs） 和 9 个正常胰管组织；进行全外显子组测序 (WES)、全基因组测序 (WGS)、RNA测序 (RNA-seq)、microRNA 测序 (miRNA-seq)、DNA 甲基化、基于TMT 标记的蛋白质组学、蛋白磷酸化组学、和糖蛋白质组学的测序和分析，产生了八组组学数据（图 1A）。
5.1.2 结果统计
蛋白质组学、磷酸蛋白质组学和糖蛋白质组学分析共鉴定和定量了11,662 个蛋白、51,469 个磷酸位点和 34,024 个糖肽。研究者发现整个 TMT plex 的质量控制样本的测量重现性很高，并且没有观察到 TMT plex 效应（图 S1A 略）。在这项研究中，RNA 和蛋白之间的相关性中位数为 0.35，表明 RNA 和蛋白丰度之间存在差异，这在其他癌症类型中也观察到。当分别对肿瘤和 NAT 进行相关性分析时，观察到 NAT组内的中值相关性相对于肿瘤组降低，这在其他肿瘤类型中也存在，这可能是由于细胞类型特异性的翻译调控。
5.1.3 低肿瘤细胞占比估计难题解决
因为这些是手术切除的癌症，绝大多数患者处于 I-III 期，只有 9 名 IV 期患者，截至到本研究数据分析时，42% 的患者还活着（图 1B），因此很多样本的肿瘤细胞并不多，纯度估计不准则会造成结果的误导。怎么办？从样本收集和计算两方面来解决。
首先，样本是在全多个来源地前瞻性地收集的，控制缺血时间，以确保蛋白的高质量PTM分析（图1B）。
接下来，根据以下几个标准确定了105个“高肿瘤纯度”的样本，余下的35个样本（140-105）就是“低纯度”。
采用哪些标准呢？
KRAS变异等位基因分数（VAF）不小于 0.075；
显著的突变负荷和拷贝数变异（CNVs）（图1C和1D）。
基于反卷积方法，使用组织学以及基于DNA甲基化和RNA的不同的分子数据模式估计肿瘤细胞占比。
经过上述三条标准，这140个样本就分为了高纯度和低纯度两组。RNA、蛋白、磷酸化和糖基化水平的主成分分析（PCA）支持了这样的分类。低纯度的样本被保留下来，用于探测肿瘤微环境和肿瘤亚型。
图1. PDAC队列的组学图表统计
(A) 队列的样本编号和组学数据类型。
(B) 队列中的来源、癌症分期、肿瘤部位和生存状态比例。
(C) 基于分子和组织学的肿瘤估计，用于将样品分为“高”和“低”纯度组。
(D) 队列中的 KRAS VAF 分布。由虚线表示的高肿瘤纯度 KRAS VAF 阈值为 0.075。未检测到 KRAS 突变的四个样本也归在“高肿瘤纯度”类，因为它们在 TP53、CDKN2A 和 SMAD4中具有高突变负荷（n > 25）、高 CNV（指数 > 1）和/或其他驱动事件。
5.2 基因组改变对转录组、蛋白组和磷酸化的影响
上述确定的105个“高肿瘤纯度”的样本纳入本分析。找到了重要的突变基因和这些突变基因的顺式和反式效应。
5.2.1 重要的突变基因
在105个具有高肿瘤细胞占比的组织样本中，在已知的胰腺癌驱动基因KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4中检测到体细胞基因组改变，其比率分别为97%、83%、48%和29%（图2A）。其中CDKN2A和SMAD4的变异百分比，由于包含了CNV和融合因此比较高。除了KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4这四个主要的突变基因，研究者还在至少5%的肿瘤中检测到ARID1A、RNF43、GNAS、KMT2C、KMT2D、TGFBR2和RBM10的改变（图2A）。
5.2.2 突变基因的顺式和反式效应
基因改变对相应基因产物（RNA、蛋白和磷酸化）的顺式和反式影响在图2B和2C中表示。重点关注了TP53,SMAD4，CNV,甲基化的效应。
TP53的效应: TP53变异在蛋白和磷酸酶水平上具有最大的反式效应，在RNA/蛋白水平和磷酸酶水平上影响的基因很不一样，这可能是由于广泛的翻译后调控。
TP53有以下发现：
TP53的突变与参与DNA损伤修复通路的蛋白（如MSH6、TP53和TP53BP1）的磷酸化增加有关，这表明这些改变在维持基因组完整性和防止细胞凋亡方面起作用（图2C）。
在TP53突变异肿瘤中，研究者还观察到MKI67更高的磷酸化，MKI67是细胞增殖的标志，这意味着这些突变可能导致细胞生长速度增加。
研究者进一步探讨了TP53错义突变与截断突变的效应比较。观察到TP53错义组与野生型组相比，TP53蛋白表达和TP53-S315磷酸位点表达的顺式效应明显更大（图S2A,略），而截断组与野生型组之间的TP53蛋白顺式效应没有明显变化（图S2A，略）。有趣的是，研究者观察到错义组和截断组都有类似的反式效应，这与DNA损伤修复通路中蛋白的磷酸化水平较高有关（图S2A，略）。
SMAD4的效应：SMAD4突变与SERPINE1在RNA和蛋白水平上的下调有关，SERPINE1是已知的转化生长因子β（TGFβ）通路的靶点，与MAPK3蛋白表达和下游的MAPK信号（E2F4磷酸化）的上调有关。这些关联已经已被报道（图2B）。
CNVs的效应：包括9p、11q、18q和22q臂的扩增；GATA6灶级扩增；以及CDKN2A缺失（图2D和2E）导致基因、蛋白和磷蛋白显著表达变化。由于观察到大量扩增，所以研究者着重于在扩增的病灶内识别新CNV驱动因素（图2E和2F）。在扩增峰内的543个基因中，有165个拷贝数与相应RNA显著相关，其中的23个也与相应蛋白的显著相关（图2F）。通过这种方法找到的蛋白体现了 CNV 事件潜在的新型顺式效应，并与肌动蛋白丝过程和细胞骨架形成相关（图 2F 和2G），肌动蛋白纤维的重组以前与肿瘤发生和转移有关。
此外，大多数受CNVs反式调控的蛋白位于7、9、17和18号染色体内，而CNVs在磷酸化水平上的反式效应比较零散，发现SMAD4和CDKN2A的CNV缺失与SMAD4和CDNK2A的mRNA水平较低有关，HDAC1在S406、S410和S421以及SMARCA4在S613的较高磷酸化与SMAD4缺失有关，而CDKN2A缺失与NPM1在S70和S214的较高磷酸化有关（图2I）。
甲基化的效应：为了鉴定肿瘤中可能受DNA甲基化调控的蛋白，研究者将RNA、蛋白和磷蛋白水平与启动子DNA甲基化进行关联。
发现：
GSTM1甲基化导致相应的RNA和蛋白下调，这与GSTM1在多种癌症中的报道一致（Wang等人，2016；Zhang等人，2017）。
启动子DNA甲基化的程度在NAT中比在肿瘤中低（图S2E和S2，F略）。
有86个表观遗传学沉默的基因，其中22个是癌症基因组图谱（TCGA）以前报道（表S2，略）。
有两个基因（ZNF544和THNSL2）在超过10%的肿瘤中发现表观遗传学沉默，与患者的生存率有明显的关联（图S2G-S2I，略）。
通过基于甲基化的亚型鉴定了两个集群（集群M1和M2），其中集群M2拥有更广泛的DNA高甲基化（表S2，略）。
研究者还观察到这些肿瘤的细胞性和甲基化状态之间的正相关（表S2，略），与TCGA研究（CancerGenome Atlas Research Network, 2017）一致。
图2. 基因组改变对转录组、蛋白组和磷蛋白组的影响
(A）具有高肿瘤细胞占比的队列（n = 105）的基因组图谱，显示频率≥0.05的突变基因。考虑了所有的突变类型，包括错义、框架转换、剪接位、拷贝数改变和融合事件。G12D、G12R和G12V是队列中最常见的KRAS驱动突变。
(B）基因组改变对RNA和蛋白水平的顺式（cis）和反式（trans）效应。
(C) 基因组改变对磷酸化顺式（cis）和反式（trans）效应。蛋白水平被用作协变量以消除与蛋白丰度有关的影响。在（B）和（C）中，顺式效应用圆圈表示，而反式效应用方块表示。
(D）队列中主要基因拷贝数的扩增和缺失率。使用的对数比阈值是[-0.4, 0.4]。
(E) 使用GISTIC检测到的显著的臂级病灶峰。
(F) CNV驱动方法示意图。从所有有拷贝数事件的基因中，有543个位于GISTIC的焦点峰，其中165个有RNA效应，23个也有蛋白水平效应。
(G）小提琴图显示了拷贝数对(F)中找到的蛋白的影响。∗∗∗p < 0.001. 作为每个比较的对照组选择无拷贝数事件的样本。
(H和I）与CDKN2A和SMAD4缺失相关的mRNA和蛋白（H）以及磷酸位点（I）的改变。以野生型CDKN2A和SMAD4的样本作为对照。
5.3 发现早期PDAC的特定分子特征，用于肿瘤诊断和预后
大约80%的PDAC肿瘤无法切除，因为患者是在晚期被诊断出来的。也就是说，随着这些患者治疗方式的出现，如果找到早期检测稳定性的生物标志物可能会提高生存率。
如何找？从发现失调的分子入手。相对于NATs而言，肿瘤中失调的蛋白、磷酸化位点和糖基化位点代表了早期检测/预后的可能标志物。
5.3.1 蛋白
相对于NATs，2218个和2244个蛋白在PDACs中分别明显下调和上调（图3A；表S3）。在NATs中具有高丰度的蛋白与正常的胰腺功能有关，而在肿瘤中上调的许多蛋白则富含参与表皮和内胚层发育的蛋白。
为了确定与PDACs相关的蛋白，研究者重点关注222个在肿瘤中相对于NATs丰度增加2倍的蛋白（图3A）。有27个蛋白在早期肿瘤中也有类似的上调（图3B）。
这27个蛋白里面，其中12个是分泌蛋白，可作为血清或胰液的早期检测标志物（González-Borja等，2019）。在胰腺癌数据库中，有11个蛋白被报告为升高，其中6个蛋白（HK2、LOXL2、COL12A1、C19orf33、TSPAN1和MDK）以前只得到RNA或细胞系蛋白组证据的支持，LOXL2蛋白丰度与总生存期缩短有关（图3C）。在图3B中强调的21个肿瘤相关蛋白中，有14个作为早期检测或预后标记的潜在蛋白目标被数据独立采集（DIA）质谱分析的正交方法验证，表明研究者报告的肿瘤相关蛋白的可靠。
5.3.2 磷酸化、糖基化位点
与NATs相比，4,908个磷酸化位点和1,727个N-链接糖基在PDACs中的丰度明显增加。一般来说，PTMs的丰度差异与蛋白水平的丰度差异相似，而45个N-链接糖位点和645个磷酸化位点的丰度上调>2倍，而蛋白丰度没有相应增加（图3D）。例如，虽然RALGAPA2的蛋白丰度在PDACs中下降（图S3C，略），但S486和S696的两个磷酸位点增加>2倍，而其他三个磷酸位点下降或与NAT相似（图S3D，略）。RALGAPA2与胰腺癌的KRAS信号传导有关（Beel等人，2020年），在未来的研究中可能需要探索这些特定位点的功能。
5.3.3 PTM位点的预后
除了蛋白丰度外，这些PTMs中有许多与患者的预后有关。
总体而言，PTMs的预后价值与蛋白的预后价值相似（图3E；表S3）。然而，APOD上的一个特定的N-链接糖基化与较好的总生存率有关，而总蛋白丰度则没有（图3F）。虽然APOD的表达减少与其他类型的癌症预后较好有关，但对这个糖基化位点的作用及其对APOD功能的影响知之甚少。
此外，参与上皮-间质转化的PIGR上的两个磷酸化位点与预后较好有关，而ERBB信号调控因子ERRFI1上的一个位点则与生存率较差有关（图3E）。
图3. 通过比较肿瘤和正常组织，识别肿瘤相关的蛋白和修饰位点
(A) 肿瘤和配对的NATs之间的蛋白丰度差异。显著增加和显著减少的蛋白的部分基因本体论（GO）生物过程术语显示在火山图上方。
(B)与匹配的NAT相比，中位倍数变化>2的蛋白，分泌蛋白用绿点表示。
(C) LOXL2蛋白丰度与总生存期相关的Kaplan-Meier曲线。两组按LOXL2丰度的中位数分开。
(D) 与匹配的NAT相比，肿瘤中的磷酸化位点和N-链接糖基化位点的倍数变化 与蛋白的倍数变化比较。
(E) 磷酸化和N-链接糖基化位点丰度与生存率的关系与蛋白与生存率的关系比较，图为“Coxregression signed p value”。
(F）APOD上的N-链接糖基化位点和APOD蛋白丰度的Kaplan-Meier生存曲线。
5.4 瞄准糖蛋白的生物合成以进行早期检测和治疗干预
5.4.1 糖蛋白差异筛选
大多数糖蛋白是膜结合蛋白或分泌蛋白，可以作为免疫治疗和疾病检测的潜在对象。PDACs和NATs的糖蛋白质组学分析确定了75种N-连接糖蛋白在肿瘤中蛋白水平上调>2倍（图4A）。其中，57个是在胰腺癌数据库中报道，18个是在本研究中新发现的。在75个肿瘤相关糖蛋白中，有48个通过DIA分析得到进一步验证（表S4，略）。
5.4.2 热点突变所在的糖蛋白
研究者根据不同的KRAS热点突变（G12D、G12V、G12R和Q61H）进一步区分了肿瘤与正常导管组织的N-链接糖蛋白表达（图4B）。有趣的是，CEACAM5和CEACAM6在携带KRAS G12D、G12V和Q61H突变的肿瘤样本中明显上调，而这个现象并没有体现在G12R突变的肿瘤样本中（图4B和S4D）。CEACAM6是PDAC患者预后不良的标志物。
此外，从早期肿瘤中N-连接糖蛋白表达中， 发现了包括半胱氨酸结合蛋白3（LGALS3BP）的几个早期检测或治疗的候选物（图4B）。
5.4.3 糖蛋白生物合成分析
这个分析突出了多组学分析中蛋白质组和糖蛋白质组的附加价值。
总的来说，在肿瘤中上调的N-连接糖蛋白主要是由带有水杨酸和/或岩藻糖的复合糖修饰，而在肿瘤中下调的N-连接糖蛋白主要由低聚甘露糖修饰（图4C）。这些数据表明，关注PDAC中上调的N-链接糖蛋白的水杨酸化和/或岩藻糖化的糖类，可能会增加癌症的标记物的特异性。
研究者接下来根据糖基化生物合成酶的丰度水平，来研究这些糖基化改变的内在机制（图4D）。比较糖基化酶的表达，发现肿瘤中的糖基化酶，包括ST6GAL1、ST3GAL1、FUT3、FUT11、B4GALT1、B4GALT4、B3GALT5和ST6GALNAC1，相对于NATs有上调（图4E）。
其中一些糖基化酶的变化，比如肿瘤中ST6GAL1、ST3GAL1和B4GALT1的升高，在转录组水平上没有观察到（图S4F，略），突出了研究者多组学分析中蛋白质组学和糖蛋白质组学的附加价值。ST6GAL1和ST3GAL1调控水杨酸化，而FUT3和FUT11则负责岩藻糖基化，这与研究者观察到的PDAC上调的蛋白主要由水杨酸化和/或岩藻糖基化糖修饰是一致的。抑制这些酶可能作为PDAC的潜在治疗策略。
图4. 糖蛋白质组学特征确定了N-连接糖蛋白和糖基化酶，用于早期检测或治疗干预
(A) 肿瘤中N-连接糖蛋白的差异表达分析，以确定与NATs相比，肿瘤中最重要的分泌型（突出显示）和膜型N-连接糖蛋白的升高。
(B) 相对于NATs和正常组织，所有肿瘤、早期肿瘤或具有不同热点KRAS突变的肿瘤中N-链接糖蛋白表达水平的上调。
(C) 全蛋白质组学和糖蛋白质组学的表达比较分析。IGP，完整的糖肽；HM，高甘露糖型糖肽；Fuc，岩藻糖基化糖肽；Sia，硅藻糖基化糖肽。
(D) 肿瘤和NATs中完整的糖肽丰度和糖基化酶的蛋白水平的关联。
(E) 肿瘤和NATs之间的N-链接糖基化酶的蛋白表达差异。
5.5 激酶和底物的共同调控揭示了潜在的治疗靶标
研究者分析了由激酶对其各自的磷酸化底物调控的蛋白磷酸化事件，以寻找可能的药物靶标。
由于具有KRAS驱动基因突变的肿瘤很难通过靶向治疗进行治疗，对于KRAS突变的PDAC，仍然难以实现有效的治疗干预。在胰腺癌发生过程中，蛋白磷酸化大量参与各种信号通路，研究被激活的KRAS下游的信号转导通路，可以寻找可供选择的药物靶标。
通过分析41个肿瘤/NAT配对组织之间磷酸化肽的差异丰度，研究者瞄向了五个磷酸化底物（MCM2、FLNA、BAD、MAPK6和STAT3）与五个激酶（CDK7、AKT1、PAK1、PAK2和SRC），这些激酶的抑制剂要么被美国食品和药物管理局（FDA）批准，要么正在研究（图5A）。
此外，通过评估不同KRAS热点突变的肿瘤中相对于NAT的磷酸位点表达变化，研究者还找到了7个FDA批准的药物靶点。
研究者提出，联合抑制PAK1/2和KRAS下游通路，如MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR，可能会通过最大限度地抑制肿瘤细胞的增殖、运动和对细胞骨架的信号传导来增加治疗效果。
图5. 激酶和底物的共同调控
(A) 41个肿瘤/NAT配对组织之间的分层磷酸化底物（顶部）和其相关激酶（底部）的丰度差异。
(B) 所选的磷酸化底物和激酶的通路，以及相关的药物。标记了PDAC肿瘤和NATs/正常组织之间mRNA和/或蛋白/磷脂的表达变化。
(C) PAK1和PAK2相关蛋白在转录组和蛋白组水平的表达概况。
(D) PAKs在正常组织、NAT、肿瘤和早期阶段的表达情况。
(E) 热图显示不同KRAS热点突变中激酶的升高。这些激酶是根据其上调的磷酸化底物确定的。药物靶点注释来自人类蛋白图谱（https://www.proteinatlas.org/），同时还有基于癌症药物敏感性基因组学（https://www.cancerrxgene.org/）对PDAC细胞系的药物敏感性评估得分。星号代表两组之间的显著差异（Benjamini-Hochberg调整后的P）。∗p＜0.05；∗∗p＜0.01；∗∗∗p＜0.001；N.S.，不显著。
5.6 与内皮细胞重塑、糖酵解和细胞连接失调有关的免疫冷PDACs
与其他肿瘤不同，PDACs对免疫检查点抑制剂普遍耐药，利用全面的蛋白基因组学方法可能会对这种现象有所了解。PDAC在很大程度上受肿瘤微环境特征的驱动。在这里，研究者根据微环境细胞特征来划定免疫浸润的程度， 并对“冷热”划分以后的肿瘤进行了RNA、蛋白和磷酸化数据进行了通路分析。
5.6.1 “冷热”划分
研究者使用基于转录组学的反卷积方法（Aran等，2017）来划分本研究中所有140个肿瘤样本的细胞组成。根据肿瘤/基质/免疫细胞组成，样本被分为四个群组（图6A）。
研究者提出， 需要特别值得关注的是D群肿瘤，其CD8+T细胞浸润较高，并伴随着细胞毒酶和免疫检查点分子的表达增加。研究者将这一集群的样本注释为 "免疫热 "肿瘤。而集群A、B和C中的样本几乎没有显示免疫浸润。由于集群A富含非肿瘤性的腺泡和胰岛细胞，研究者认为只有集群B和C是真正的 "免疫冷"肿瘤组（图S6F，略）。
做好冷热分组，接下来开始通路分析。
5.6.2 通路分析
为了进一步确定免疫冷表型的机制，研究者使用RNA、蛋白和磷酸化数据进行了通路分析。分别发现了内皮细胞重塑、糖酵解和细胞连接失调这几条关键通路。
内皮细胞重塑：队列中的免疫冷肿瘤的内皮细胞粘附蛋白的表达减少（图6C）。同时，这些肿瘤还显示出血管内皮生长因子和缺氧通路的活性升高，这一点从血管内皮生长因子及其受体的表达以及推断的通路活性来看（图6D）。
血管内皮生长因子和缺氧通路都是肿瘤发生过程中内皮细胞重塑的组成部分（Petrova等人，2018）。这些结果共同支持了内皮细胞重塑和抑制免疫性PDACs的免疫浸润的关联。内皮细胞代表了循环系统和肿瘤细胞之间的物理连接（Klein，2018），内皮细胞粘附蛋白对免疫细胞招募至关重要，并且在肿瘤相关的血管中经常下调（Schaaf等人，2018）。
糖酵解：免疫冷样本的糖酵解水平较高（图6E和S6H），包括负责生成和分泌乳酸的酶的富集，乳酸是肿瘤微环境中已知的免疫抑制剂（de la Cruz-López等人，2019）。
细胞连接失调：磷酸化特异性通路富集分析显示，免疫冷样本的细胞连接蛋白的磷酸化水平较高（图S6I）；这一特征在转录组或蛋白组水平上没有显著性（图6F）。细胞连接蛋白在调控内皮细胞对小分子的通透性和免疫细胞浸润方面发挥着重要作用。在这里，研究者的结果表明，细胞连接成分中的蛋白磷酸化失调可能代表了PDAC肿瘤中免疫排斥的一种机制。
这些数据共同表明，内皮细胞重塑，伴随着血管内皮生长因子和缺氧通路的升高，糖酵解增加，以及细胞连接失调，可能共同抑制了免疫细胞的浸润和功能（图6G）。抑制这些生物过程，可能用来提高免疫治疗的疗效。而且这一点得到了与这些过程相关的临床结果的支持。虽然CD8+T细胞浸润是一个有利的预后标志，但血管内皮生长因子和缺氧通路信号的升高都与生存率下降有关（图6H和6I）。
图6. 划分PDAC肿瘤的细胞组成并确定造成免疫冷表型的生物事件
(A) 根据肿瘤的组成，将140个肿瘤分为四个群组（上部热图）。细胞毒性T细胞，连同富集在集群D中的内皮细胞，被一个矩形所强调。免疫细胞毒性因子和检查点基因的表达按样本顺序显示（下部热图）。
(B)根据使用xCell或MCPCounter的反卷积，比较免疫热和免疫冷样品的内皮细胞。
(C) 免疫冷的肿瘤的内皮粘附蛋白减少。
(D) 免疫冷藏的肿瘤有上调的血管内皮生长因子和缺氧通路。
(E) 免疫冷藏的肿瘤具有更高水平的糖酵解通路成分。显示的是这些成分在RNA和蛋白水平上的免疫冷与热之间的比较。一些通路成分被确定为已知的功能性磷酸位点，并以棕色圆圈突出显示。
(F) 磷酸化通路富集显示，免疫冷样品的细胞连接蛋白的磷酸化水平更高。显示的是免疫冷与热的蛋白磷酸化、蛋白表达和RNA表达的倍数变化。∗p < 0.05, Student's t test.
(G）与免疫排斥相关的可能模式。
(H）与CD8+T细胞相关的临床结果。
(I）与VEGF和缺氧通路活动相关的临床结果。
在（B）-（D）中，∗∗p＜0.01；n.s.，不显著（学生t检验）。在（H）和（I）中，p值来自于对数秩检验，括号内的数字代表每组的样本量。
5.7 具有强烈预后意义的蛋白基因组亚型
为了减轻肿瘤纯度对亚型划分的影响，研究者基于NMF的蛋白基因组学亚型， 对105个具有高肿瘤细胞占比的PDAC肿瘤进行亚型分析。这一分析显示了两个集群（C1和C2；图7A），两种亚型之间的差异更有可能反映肿瘤内在的生物信号，比如C2亚型与多种增殖性信号通路的活性升高和生存率较差有关（图7B和7C）。
为了对这两个亚型进行深入分析，研究者将分子特征、激酶的磷酸化模式、糖基化酶和综合蛋白基因组学提示的标志物，与C1和C2亚型相关联。C2亚型与图5强调的大多数激酶的高表达有关。基因组富集分析显示，化疗药物与C1（如多西他赛、乙烯利和卡巴他赛）和激酶抑制剂与C2（如PP-242、CP466722和舒尼替尼）有关联，C1或C2亚型中预测的相应药物靶点的表达升高进一步证实了这一点。例如，mTOR、AKT和ERK激酶表达的升高以及PP-242签名在C2中的富集表明，mTOR可能是这些患者的潜在治疗目标。
亚型与患者结局的关联。对预后不佳的蛋白基因组基底样亚型（图7B）中过度激活的增殖和信号通路进行进一步的实验研究，可能有助于开发亚型的特异性治疗策略。
图7. 使用基因拷贝数、mRNA、蛋白、磷酸基和糖基丰度对105个高纯度肿瘤进行蛋白基因组亚型划分，大体上将肿瘤分为两个亚型
(A）热图描述了由NMF确定的分离两个集群的蛋白基因组特征的Z-评分丰度。聚类成员得分对应了每个样本与一个给定聚类的关联强度，按比例权重计算。矩阵的各列按蛋白基因组亚型和集群成员分数的递减排序。
(B) 对蛋白基因组亚型的通路级分析。显示的是来自单样本基因组富集分析（ssGSEA）的癌症标志基因组的通路活性得分，应用于表征每个聚类的特征权重向量。星号表示错误发现率（FDR）<0.01的基因组。
(C）每个蛋白基因组亚型的临床变量、RNA亚型和体细胞突变的过表达分析（P值来自Fisher精确检验）。点的大小与关联的重要性成比例。青色的点表示与C1亚型的关联，橙色的点表示与C2亚型的关联。垂直虚线对应的名义P值为0.05。
(D-G)Kaplan-Meier图比较了分配到蛋白基因组经典集群（C1）和蛋白基因组基底样集群（C2）的莫菲特经典样本（D）、分配到两个蛋白基因组集群的莫菲特基底样样本（E）、两个蛋白基因组集群（F）和两个莫菲特亚型（G）之间的生存结果。P值来自于对数秩检验，括号内的数字代表每组的样本量。
6 讨论
6.1 高质量的数据如何获得？
为了确保PDACs与成对匹配的NATs和正常的导管组织比较结果可靠，研究者利用分子学、组织学和算法，来注释队列中肿瘤的肿瘤细胞占比和正常组织的高腺泡含量，其主要目的是使得分析中只包括高质量的样本（图1和2），能帮助对早期检测、诊断或治疗干预的潜在靶标识别（图3、4、5、6和7）。
6.2 靶向KRAS的新方法是什么？
既往研究：人们普遍认为KRAS是PDAC的主要驱动基因，然而针对KRAS蛋白本身的治疗已经失败，因为它的表面拓扑结构光滑，缺乏安全药物结合的疏水口袋，导致除了化合物MRTX849(Adagrasib, KRAS G12C抑制剂)之外，获批的KRAS特异性药物很少，而且只有不到1%的PDAC患者身上携带了KRAS G12C突变。KRAS突变靶向治疗成了很多医生和患者头疼的问题。除了检测KRAS突变本身，靶向治疗也瞄向了抑制KRAS关键的下游信号。
本次结果：研究者验证了KRAS是PDAC的主要驱动基因（图1和2），与之前的研究一致。除了观察变异，研究者把目光放在糖蛋白表达、通路调控上。
首先，比较具有不同热点KRAS突变的肿瘤的糖蛋白表达，发现携带G12D、G12V和Q61H突变的PDAC样本中，CEACAM5和CEACAM6显著上调，但是携带G12R突变的样本无此变化（图4B）。
CEACAM5和CEACAM6有哪些特殊呢？它们属于免疫球蛋白超家族；通过与其他蛋白的同亲和异亲结合，介导细胞迁移、细胞侵袭和细胞粘附；并保护肿瘤细胞不发生失巢凋亡(Anoikis，细胞自杀的一种行为）；在临床前研究中，mAbs MN-15和MN-3可以通过减少肿瘤细胞对内皮细胞和细胞外基质的粘附而阻碍转移。
紧接着我们看通路调控。
除了糖蛋白表达，MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路是PDAC治疗干预的主要目标，每条通路的多种抑制剂都可以在临床上使用。此外，研究者瞄准了PAK1/PAK2激酶。
研究者对蛋白质组学和磷蛋白质组学检测的整合发现，在研究者队列中的大多数PDAC中，PAK1/PAK2激酶被上调（图5），这些激酶已被报道为介导细胞骨架运动、增殖和生存的重要信号通路的关键效应因子/调控因子。PAK1/PAK2位于肿瘤基因KRAS的下游，其抑制剂有可能成为靶向KRAS的新方法。
启发：糖蛋白质组学提示，抗CEACAM5/6药物与一线化疗相结合，可能会使携带KRAS G12D、G12V和/或Q61H突变的PDACs患者受益；蛋白质组学和磷蛋白质组学结果提示，PAK1/PAK2抑制剂可与靶向KRAS下游MAPK/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/mTOR通路的抑制剂相配合，可能成为靶向KRAS的新方法。
6.3 胰腺免疫冷肿瘤应该怎么办？
既往研究：PDAC的特点是高度抑制性的肿瘤微环境，对于大多数患者来说，细胞毒性T细胞的瘤内浸润很低。尽管针对细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的免疫疗法使几种实体恶性肿瘤患者明显受益，但除了占PDACs<2%的微卫星稳定性高的肿瘤，它们对PDACs患者无效。人们对PDAC中免疫激活的决定因素知之甚少，几乎没有提供治疗指导。
本次结果：为了剖析肿瘤微环境，研究者利用研究者的多组学数据，发现与VEGF和缺氧通路活动上调相关的内皮细胞的缺失，反过来又与免疫冷肿瘤中的免疫细胞排斥有关（图6）。
启发：针对HIF-1活性的方法，如防止HIF1-α和HIF1-β亚基相互作用的小分子，也可能对胰腺免疫冷肿瘤有益。因为将肿瘤内皮细胞修饰成正常的内皮细胞表型可能是通过抗血管生成疗法（比如索拉非尼和NGR-TNF）实现的，使得白细胞内皮细胞粘附分子上调，来促进瘤内免疫细胞浸润。低氧诱导因子-1（HIF-1）是胰腺肿瘤中低氧微环境的主要效应器，并诱导细胞代谢进入糖酵解模式。
6.4 糖基化修饰与肿瘤如何相关？
既往研究：N-连接糖基化发生在内质网和高尔基体，由一系列糖苷酶和糖基转移酶的活性介导。在包括PDAC在内的各种实体恶性肿瘤中，已经发现了水杨酸糖蛋白的异常表达，并与侵袭性和转移潜力有关。
本次结果：研究者已经表明，PDAC中大多数上调的N-链接糖蛋白是由水杨酸糖修饰的，与PDAC中ST6GAL1和ST3GAL1相对于NAT的上调一致（图4）。这些肿瘤上调的N-链接糖蛋白与参与PDAC进展和转移的重要信号通路有关（图S4B，略）。
启发：因此，用更具选择性的抑制剂来抑制这些水杨酸转移酶，可能会通过废除这些N-链接糖蛋白的功能来减弱PDAC细胞的生长、存活和转移（Garnham等人，2019；Vajaria等人，2016；Macauley等人，2014）。
7 文章总结
对PDAC的全面多组学分析，以提供对基因组和表观基因组扰动对基因和蛋白表达以及PTMs的影响的见解。
整合转录组、蛋白组、磷蛋白组和糖蛋白组的检测，以及PDACs、NATs和正常导管的比较分析，使研究者能够检测出与早期PDAC相关的蛋白形态，并确定可能在临床上找到的潜在治疗目标。
总的来说，研究者的研究找到驱动PDAC表型的分子特征，以促进临床转化。
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