DIA修饰蛋白质组数据攻略—以磷酸化修饰为例（二）

上回说到，我们可以轻松在Spectronaut中实现PTM项目的检索，并且能根据分析需求在Report中可以直接查看以及导出以位点为中心的定量数据。传送门：DIA修饰蛋白质组数据攻略—以磷酸化修饰为例（一）

今天接着填坑。

还想统计修饰肽段相关信息怎么办？虽然软件暂时还不支持一键式输出这类结果，不过follow me，点几下就能拿到了。

在已分析完成的SNE文件Analysis界面，点击左侧小齿轮，Quantification界面下，将Minor Group下拉框更改为Modified Sequence，至于下拉框中三个分别代表什么意思，有什么区别，传送门again：关键字解读：Protein、Protein Group、Peptide、Modified peptide、Precursor

Report→Pivot Report→Peptide Quant→勾选”EG.ModifiedSequence”和”PEP.Quantity”→勾选”No Decoy”→”Export Report”，在表格中针对”EG.ModifiedSequence”列进行筛选，保留含”Phospho(STY)”并去重，则能统计整个项目所鉴定到的磷酸化肽段，当你想要统计该项目中某样本所鉴定到磷酸化肽段数时，可在此基础上去除样本对应列缺失值，统计剩余有值部分即可。

由于软件自动计算的富集效率是基于Precursor水平，若是想在肽段水平计算富集效率，用筛选后留值除以该列总数就是。此时对应样本列对应的”PEP.Quantity”即是磷酸化修饰肽段对应的肽段定量值信息。

拿到鉴定的修饰位点定量信息表格，我们就可以开始数据质控。使用我司质控平台EasyDIA（https://project.omicsolution.com/EasyDIA/），可以从鉴定深度、稳定性、重现性等方面对实验前处理、液相方法、柱效稳定及质谱状态多维度进行评估，PTM专区还能直接统计磷酸化肽段以及位点。

往期回顾：EasyDIA，即使封城也可以让你的蛋白质组实验高枕无忧

想要厘清修饰组的差异是由于修饰本身还是受到对应蛋白量变化导致，一般会基于全蛋白质组水平做本底扣除标准化。常用标准化方法为位点定量值（log2转换）- 位点对应蛋白定量值（log2转换），文献doi:10.1038/s41467-020-20509-1。也就是说，需要在前处理和质谱采集时采集全蛋白质组与修饰组两套数据。

虽然，在修饰组分析中，也能获得该修饰位点对应的蛋白的定量值，但该值是经过修饰肽段富集之后得到的蛋白表达量，与实际的蛋白本底表达水平不一定一致，参考意义不大。如关注本底蛋白表达水平，建议采用同一批样本进行全蛋白质组检测。

数据检索时，无特殊需求，可直接无脑操作。全蛋白质组选用”BGS Factory Setting(default)”模板；修饰组选用”BGS Phospho PTM Workflow”模板。

搜索结束后，在各自的Report中分别导出全蛋白质组相应定量表格，表头主要含【PG.ProteinAccession/PG.Quantity】；修饰位点定量定量表格，表头主要含【PG.ProteinAccessions/PTM.ProteinId/PTM.CollapseKey/PTM.Quantity】。

然后你会发现，位点定量值对应到蛋白都是单个Protein的形式，而全蛋白质组表格中的蛋白定量值都是以ProteinGroup的形式展现，会出现有好几个Protein显示在一行的情况。这个时候，就需要对全蛋白数据中的PG.ProteinAccession列进行拆分，变成一行一个protein对应一个定量值。

可以自己尝试或者找相熟的生信好友帮帮手写一个拆分小程序，否则如果数据量比较大的话，会拆到天荒地老（夸张），主要手拆有些容易出错。

对于那些磷酸化蛋白质组中鉴定到但是全蛋白质组中没有鉴定到的蛋白，沿用原位点原始定量值就可。