DIA技术转化重磅成果，黄超兰、高福团队新冠尿液研究实现超高深度单针定量

尿液蛋白质组的数据深度覆盖一直停留在1000-2000个蛋白/样品的水平，作为做容易获得的生物标志物筛选对象，因其难以保证检测重复性，覆盖深度问题一直无法有效作为主要的蛋白质组研究对象。而这周，易算蛋白质组学解决方案用户，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授团队，与中国科学院院士高福团队开展协同研究，基于DIA技术进行了COVID19/普通肺炎/正常人为人群的尿液蛋白质组学深度分析，实现了平均每个个体样品定量3500个左右蛋白质Group的超深度覆盖。相关研究成果以“Immune suppression in the early stage of COVID-19 disease ” 为题于11月17日线上发表在Nature Communications期刊上。

本文是目前笔者所知的尿液蛋白质组定量覆盖深度最高，也是利用DIA定量技术研究COVID19蛋白质组学结果的最新力作。

本次将主要基于这篇文献数据给大家介绍TimsTof，Spectronaut如何实现高可信、高覆盖深度定量的过程。希望对各位自己的定量蛋白质组学研究能有帮助和启发。

DIA实验流程

本文采用了最新布鲁克Tims Tof Pro质谱的DIA-Pasef定量技术联合Spectronaut软件进行了定量方面的分析，其主要步骤简介如下：

谱图库构建

作者混合了10例健康人、11例COVID19病人共88微克蛋白进行酶切和High-pH RPLC分级，采用经典Waters BEH C18柱得到62个馏分，前后合并得到31个馏分，并掺入iRT标肽进行DDA谱图库构建，液相参数为90分钟梯度300nL/min流速，色谱柱为自填1.5um Dr Maisch ReproSil-Pur 120 C18填料，25厘米柱长。质谱采用最新布鲁克 TimsTof Pro DDA-Pasef模式采集，其高性能离子淌度模式可以实现高灵敏快速MS2采集。得到的数据采用来自易算提供技术支持，瑞士Biognosys公司Spectronaut的Pulsar数据分析引擎，建库采用最严格的PSM, 肽段， Protein group 三重 1%FDR质控，最终得到高可信度的6346个Protein Group的尿蛋白谱图库，这个数据规模也是目前笔者所知覆盖最深的尿液蛋白质谱图库。

谱图库结果总结

谱图库母离子分布，可以看到400-1200涵盖了96%以上的母离子，因此作者最后对这部分信号进行了DIA采集。

点评

1.充分有效的分级，62个馏分前后合并有效降低了肽段复杂度，不过最终31个分级上机检测数据工作量极大，一般实验室可以考虑缩减到最终8-12个馏分进行检测，覆盖深度有所下降，但检测工作量也能减轻不少，可以自行斟酌；

2.COVID19病人和健康人混合建库可以减低建库工作量，各位老师在参考该方法的时候也需要预先对自己的实验对象的蛋白组成情况有所把关，尽可能选择SDS-PAGE电泳条带正常，相似的样品混合，如果不同分组间的条带分布差异较大，或者部分样品存在明显与其他样品不同的高丰度，建议从建库样品中剔除，以免干扰整体建库质量。另外也可以考虑不同分组差异较大的情况下分别混合建库。可以有效提高建库质量。

3. 质控，Spectronaut的Pulsar引擎是目前最新的DDA/DIA数据分析算法引擎，有效保障高灵敏鉴定的同时极大的降低虚报假阳性的情况，是目前DIA 谱图库构建流程中必不可少的步骤。

4. 色谱柱采用1.5um超细颗粒填料，对液相压力、使用者的操作能力提出非常高的要求，建议大家酌情参考，如的确希望实现相近的色谱表现却担心实际操作难度的，可以联系易算采购一体化即插即用的IonOpticks 1.6um填料柱，虽然性能略低于本文色谱柱性能，但更适合新手使用；

5. 液相梯度尽可能保证DDA采集和DIA采集一致，以最大化序列覆盖并减少假阳性情况；

6.为了实现深度覆盖定量，谱图库的有效构建可以大大提升DIA定量效果，但如果条件不允许，亦可以尝试不建库直接采用Spectronaut的DirectDIA方式进行DIA定量，该步骤不需要构建谱图库，直接基于Pulsar引擎的机器学习算法进行DIA谱图直接定性、定量分析。当然结果会比DDA谱图库策略少5~20%的结果数量。根据实际情况选择

DIA实验液相及质谱效能、稳定性评价

本文采用了TimsTof Pro 的DIA-Pasef模式对每个样品进行数据采集和定量，作者对离子淌度和m/z数据评估后优化了DIA采集窗口，最大化了定量结果

液相分离效果
TIC分布均匀，出峰良好，没有出现中断、异常波动，整个90分钟内有效梯度时间大于80分钟。表现优异
色谱峰宽
色谱性能的主要评价指标是半峰宽和峰容量，两者也是直接相关。本次实验半峰宽约为6-7秒，极其优异，相应的峰容量接近500，有力保障了深度覆盖定量结果。
DIA窗口设置
上图可以看到，经过窗口优化，有效排除了单电荷干扰同时将肽段进行了有效的分窗口采集。
离子淌度相关性
离子淌度相关性分布可以看出，TIMS的稳定性非常高，理论IM和经验IM基本一致。
质量轴偏差矫正
尽管Spectronaut无须预先评估质谱质量轴偏差情况，全自动矫正，但实际质量精度表现也可以间接证明实验质量。从MS1和MS2的质量偏差分布看，作者实验室的仪器维护稳定性非常之高，保持在3.5ppm偏差范围内，有力保障了定性定量的可靠性。
XIC提取范围
色谱稳定性越好，相应DIA谱峰和谱图库提取谱峰间的XIC窗口就越小。该实验平均提取窗口为3分钟左右，表明整个系统的稳定性高度一致。
定量数据点Date point per peaks，DPPP
该指标由每个可定量的谱峰数据点计算得到，与色谱峰宽负相关，与质谱扫描速度正相关，与DIA窗口数量负相关。因此研究者需要谨慎平衡三者之间关系，尽可能保证每个定量谱峰有6-8个DPPP，从而实现最准确的定量结果。
本次结果平均实现MS1 7 DPPP，MS2 7DPPP，DIA定量的一大优势就是既可以MS1定量亦可以MS2定量，而Spectronaut软件可以实现两者同步评估，报告最优化结果，但要实现该目的首先MS1和MS2的DPPP都需要设计合理。本实验两者均实现了最优化的7DPPP结果，使得精确定量轻而易举。
平行定量结果的变异系数
整个系统随着样品检测而产生的系统误差直接影响了大样本量蛋白质组定量的最终结果。本实验每4个样品即插入一个QC样品评价系统稳定性，最后实现了低于19%的CV，从而有力保证了整个实验定量的准确性。
定量归一化
从归一化结果来看整体信号一致性较好。
定量结果分布
以上蓝色代表COVID19样品，绿色代表健康组，红色代表普通肺炎组。左图横坐标为色谱保留时间，纵坐标为相对定量ID分布，中间的图横坐标为Log10信号强度，右图横坐标为m/z。
可以看到RT和m/z分布均十分均匀表明样品检测分离效果良好。信号强度越高，定量成功概率越高，也符合客观规律。但我们可以看到总体来说COVID19样品的定量结果均略差异其他两组，间接证明了灭活和采样复杂度的确对整体分析效果存在负面影响。由于COVID19样品的高度危险性，该影响不可避免。

点评

各位可能觉得DIA需要注意的因素太多了，好像比其他方式定量更麻烦，其实不然，我们总结的这些影响因素除了窗口设置外，其他大部分内容一样对非标，标记定量实验有关，只是不进行大样本临床分析的话大部分研究者并不会特别关注这些，但一旦进行大样本量分析，为了保证结果前后一致性，就非常有必要对整体分析结果进行全面质控，否则很容易发现的差异其实来自于系统或人为误差。如果您的实验同样希望做到高度可靠，可以联系易算来协助您提高质控水平；
高性能的色谱、质谱以及优化良好的分析参数最终使得尿蛋白质组单针DIA定量实现了平均3500个定量覆盖深度的结果，该结果有力的帮助了COVID19的研究，从而证明蛋白质组学研究对公共卫生、生物学、疾病研究的有力促进。但相对于传统研究手段，蛋白质组学的整个分析流程较长，注意点非常之多，因此要做好临床蛋白质组学研究的门槛较高，各位研究者应该对此有清醒的认识。
DIA技术是目前临床或大样本蛋白质组学研究的不二选择，而易算提供的整套从实验样本处理到分离分析以及数据分析的解决方案能够有力的帮助研究者得到最佳的分析结果。

我们在此抽丝剥茧的以黄教授最新研究成果为大家展示了如何做好一套完美的蛋白质组学定量实验，希望能帮助各位得到心仪的实验结果。

同时，围绕DIA定量技术，易算提供了一系列解决方案：