DIA+PRM宏蛋白组揭示茅台酒曲中的微生物群落组成和代谢特征
近几年来，宏蛋白质组学成为科研热点，越来越多的实验室和企业投身于这一领域的探索之中。然而，要取得显著成果其实充满挑战，比如怎么构建蛋白质序列比对数据库，使用何种质谱技术检测样本，还有那让人头疼的海量数据怎样通过软件来处理和分析。在这里，易算生物联手该领域的前沿专家乔亮教授和他的团队，经过多年研究创新与技术积累，打磨出一套全面且实用的操作方案。无论您是想自己搭建研究平台，还是想和我们合作科研项目，我们这套方案都能帮到您。
接下来将以乔亮团队的两篇文章为例，介绍DIA技术、Spectronaut软件和生信分析在茅台酒曲宏蛋白质组研究中的应用。
茅台酒是最受欢迎的中国白酒之一，白酒的特殊风味和香气与酒曲发酵过程中产生的微生物群落有关，微生物群落的变化会影响白酒品质和产量的稳定性，因此对白酒酒曲中的微生物进行分析至关重要。微生物蛋白质是在酿造过程中发挥各种生物学功能的分子，通过宏蛋白质组对茅台酒曲的微生物群落组成及其蛋白功能特征进行分析，将对茅台品质和产量提供指导。
图中红色填充为宏蛋白组研究流程，蓝色填充为两个项目所使用的具体方法，灰色字体为可选方案。此外，第一篇文章做了关键酶PRM靶向验证。
涉及实验：
样本：第一篇文章收集一年中不同时间6道工序总共42例大曲样本，每组7个生物学重复；第二篇文章收集了白黑黄3种类型*春夏秋3个季节总共90例大曲样本，每组10个生物学重复。
DIA质谱：全面分析大曲样品（茅台酒曲）中的微生物蛋白和肽段。
PRM质谱：验证特定蛋白质或肽段的定量（第一篇文章）。
宏基因组：用于构建样本特异性的蛋白质序列数据库。
生信分析：物种层面--识别整体优势物种、组间差异物种筛选、组内菌群共现网络、菌群α多样性；蛋白层面--样本聚类分析、差异蛋白筛选、功能通路注释、eggNOG注释。
一、宏蛋白质组数据特征
采用Spectronaut-directDIA检索数据，生信统计蛋白数量和物种丰度。从图中可看出，茅台酒曲的组内定量蛋白数量和菌群组成非常接近，表明基于DIA+Spectronaut的宏蛋白质组检测结果是稳定可重复的，以及表明该流程在大样本队列研究中的潜力。对于PCA分析和物种组成丰度堆叠图，我们可以看出某些组别之间具有更相似的特征。比如第一篇文章中，第1道工序；第2、3、4道工序；第5、6道工序表现出3种特征，因此后续将6道工序重新分为3个组别G1；G2；G3。而第二篇文章中，白大曲的春夏秋3组的菌群组成和丰度分布相似，表明其具有季节稳定性。此外，堆叠图中还显示两个项目中芽孢杆菌属的丰度均丰富。
第一篇：42例茅台酒曲的宏蛋白组数据特征
第二篇：90例茅台酒曲的宏蛋白组数据特征
二、物种分类组成比较
比较不同组之间的显著差异物种，通过箱线图和进化分枝图进行可视化，可以看出哪些差异物种在哪些组别中更丰富。通过菌群多样性分析，可以看出哪些组别的菌群多样性更高。结果显示，第一篇文章，9种差异芽孢杆菌在G3中高表达，此外，G3的整体菌群多样性也最高；第二篇显示，白大曲的3个季节菌群多样性均稳定最高，而黑大曲的菌群多样性具有季节差异性，在秋季最低。进化分枝图显示黑大曲在秋季显示出较多的季节性上调物种，说明秋季黑大曲含有更多可发酵的微生物。
此外，第一篇文章还针对菌群绘制了组内共现网络图。结果发现，不同工序大曲的菌群共现网络表现出不同的连通性模式。总的来说，芽孢杆菌的连接性较高。
第一篇：优势物种和差异物种分析
第二篇：差异物种比较
三、 差异蛋白功能分析
筛选组间差异蛋白，并对其进行通路注释，结果发现主要涉及碳水化合物代谢和氨基酸代谢。第一篇进一步根据各通路注释的所有蛋白的定量结果计算KEGG通路的丰度，发现G3中氨基酸代谢显著上调。同样地，第二篇对关键蛋白表达进行热图可视化，发现相较其他季节，秋季黑大曲的糖酵解和柠檬酸循环相关酶具有更高表达。总之，这些通路和酶与糖化过程和茅台白酒风味物质形成有关。
第一篇：差异蛋白通路注释及通路丰度热图
第二篇：关键通路中的差异蛋白丰度热图（含蛋白物种注释）
四、 糖化过程中的关键酶定量比较
利用eggNOG数据库对定量蛋白进行酶学功能注释，对糖化过程相关酶进行定量比较。其中，第一篇文章采用PRM靶向方法对相关酶蛋白进行了定量验证，箱线图可视化显示这些蛋白在G3中低表达，并且这些酶蛋白主要来自于真菌而非细菌。第二篇文章直接采用DIA定量结果对相关酶表达丰度作了热图可视化，结果显示这些酶在夏季黄大曲中表达更高。
第一篇：PRM定量验证关键酶蛋白表达
第二篇：关键酶的DIA定量结果热图可视化
1. 生信分析关键菌、酶和通路的丰度变化：第一篇通过物种分析发现优势菌芽孢杆菌在G3中丰度最高。通过eggNOG注释及PRM定量发现糖化酶在G3中较低。对差异蛋白进行功能分析发现，氨基酸代谢在G3中上调。第二篇采用相似地生信分析流程，结果发现白大曲具有较高的菌群多样性和季节稳定性。黄大曲夏季的糖化酶丰度较高。黑大曲秋季的碳水化合物降解活跃。
2. DIA+PRM技术联合：采用DIA定量宏蛋白质组方法研究了42例和90例茅台酒曲样本的菌群组成和蛋白功能谱。组内稳定的蛋白数量说明DIA检测结果的高度稳定性，以及表明该流程在大样本队列研究中的潜力。进一步通过PRM靶向验证白酒发酵过程中微生物产生的特定代谢酶丰度和活性，说明其对白酒产量和特殊风味化合物形成的影响。
3. Spectronaut+SpectroDive软件联用：随着Biognosys的两款软件功能不断升级，对DIA和PRM数据的解析将带来很多方便。文中DIA数据采用Spectronaut-directDIA流程搜库，兼顾鉴定深度和稳定性以及性价比；PRM数据采用SpectroDive搜库，拥有目前最智能化的谱峰提取算法，兼顾鉴定准确性和操作简便。
基于Spectronaut的DIA三大解决方案
1）基于DIA搜索引擎（Pulsar）的directDIA分析：Spectronaut是业界领先的无谱图库DIA分析(directDIA™)工具，提供了一个快速的，节省成本、替代传统的DDA谱图库的分析方法。
2）传统谱图库DIA分析：将混合样品进行分级，建立DDA/DIA/PRM谱图库，结合iRT试剂矫正，将DIA数据快速矫正并与谱图库比对进行定性定量，与directDIA相比，能够得到更大化蛋白组覆盖。
3）合并谱图库DIA数据分析——Hybrid：同时对DIA数据和分级谱图库/已有数据进行定性分析及机器学习，并且采用Pulsar的Hybrid搜索功能将谱图库/已有数据与DIA建立一个合并谱图库。样本DIA数据通过比对合并库将获得更深的覆盖深度。
应用场景：对粪便、肠道内容物、酒曲、发酵物、土壤、淤泥等复杂样本类型（非单一物种的样本）进行微生物组成及其功能代谢研究。
技术层面：通过上述两篇茅台酒曲的研究文章，我们不难发现DIA+Spectronaut宏蛋白质组方法的广泛应用，尤其是针对大队列样本研究中具有显著优势，同时结合PRM+SpectroDive靶向蛋白质组，发现并验证特定代谢酶活性。
分析层面：宏蛋白质组分析可以分为两个层面，一是对微生物组成的丰度特征分析，识别整体优势物种、组间差异物种筛选、组内菌群共现网络、菌群α多样性等；二是对微生物蛋白进行功能特征分析，包括差异蛋白筛选、功能通路注释、通路丰度热图等。
方案层面：
对于DIA宏蛋白质组研究，易算生物和复旦大学化学系乔亮团队联合搭建了完整的方案流程，从构建蛋白序列数据库（宏基因 / 16S rRNA / 开发基于公共数据的建库新策略）、构建谱图库（深度分级谱图库/预测谱图库/谱图库与DIA本身合并建库）、Spectronaut软件搜库鉴定（谱图库DIA / directDIA / Hybrid-DIA）到数据分析与可视化，有多种选择方案。
对于可视化图表，可以从肽段、蛋白、物种层面比较不同组别之间的数量差异和丰度差异；对差异蛋白作功能注释和通路富集，了解整体或特定微生物的代谢特征变化及其关键蛋白；对物种分类的丰度可视化、菌群多样性分析以及丰度差异与标志物分析，可以帮助筛选出样本中的优势菌（属）。
易算生物宏蛋白质组数据分析的部分demo展示：
在这里，我们想借此机会邀请更多研究人员加入到DIA宏蛋白质组学的研究中来。我们可以从自动化蛋白前处理、蛋白序列库和谱图库构建、Spectronaut软件搜库策略、数据生信分析到后续的PRM-SpectroDive靶向关键蛋白验证，为您提供详细的方案设计和产品工具。未来，我们还计划推出更多创新方案，诚邀您一起开启这一探索旅程。