directDIA+为您点亮质谱数据中的黑暗角落

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农历新年的脚步正悄悄靠近，不知道屏幕前的你是否在过去的一年中有什么值得铭记的瞬间呢？2022年注定已成为过去，希望你能尽量不被时代裹挟，多多少少在精神世界能有一丝满足和进步。

2022对于Spectronaut来说，也是不平凡的一年，一代又一代，如今已到version 17，也希望这一年的高产似母猪的迭代速率能为各位组学人的数据分析添上一把柴，镌刻下通过点击几个按钮就能看到理想结果小火苗时眼前一亮的瞬间。

在最新版Spectronaut 17更新发布以后，我司针对Hela标肽，EasyPept EX极微量样品，单细胞蛋白样品，体液去高丰度DeepP以及临床大队列数据五个层面实现初步评估（定性深度再度突破，淘汰DDA指日可待：Spectronaut17发布前瞻）。全新版本在directDIA+算法上的迭代，大幅提升了鉴定深度和覆盖度，又占领了DIA数据解析的另一个高地。

那Spectronaut 17（以下简称SN17）library free directDIA+实际提升效果如何？我们针对2022年发表于Nature Communications的文章中数据比对部分做了进一步测试。

测试文章

在这篇文献中对dia定量深度的测试是基于Blood文献：DOI 10.1182/ blood.2020009741中timsTOF产出的dia-PASEF数据（PXD022216），数据选择了50例不同分型的白血病患者血液中分离的单核细胞，对比分析了DIA-NN（version 1.8.1）与Spectronaut 14数据解析能力，如下图所示，spectronaut 14（以下简称SN14）在当时的表现较于DIA-NN 1.8.1来说，略逊一筹。

图1 Spectronaut 14 vs DIA-NN 1.8.1

于是，我们针对同一套数据采用SN17与DIA-NN 1.8.1做了以下比对，搜库参数均采用library free directDIA+分析，保持与原文一致。

Precursors counts DIA-NN      SN17

Proteins counts DIA-NN      SN17

图2 SN17 vs DIA-NN鉴定数量对比图

可以看出，SN17相比DIA-NN而言，同一样本的肽段母离子鉴定深度提升29%-43%，蛋白鉴定量提升6%-15%。

其中Precursor数量的巨幅提升是非常有利于得到更高的蛋白覆盖率和更好的定量效果。

Protein counts
Precursor counts
≥2 proteotypic peptides overlap	≥1 proteotypic peptides overlap
Missing values

图3 筛选后蛋白、Precursor计数、overlap及缺失值对比

原文以≥2条proteotypic肽段作为拦截条件筛选蛋白，按此标准，SN17和DIA-NN各有千秋，相差不大，但同时我们也查看了组学文章中常规设定的筛选条件≥1条proteotypic肽段，则SN17将多出1000个蛋白计数，该现象也说明SN17提升了低丰度蛋白的检测灵敏度，但序列覆盖度的确没法更高。

以上结果均是SN17与DIA-NN的横向结果比较，体现出SN17无二的鉴定深度及广度，为了更深层次了解SN17组学水平整合能力，我们也在蛋白定性、定量以及差异蛋白筛选方面与SN14解析结果做了纵向对比。

Proteins overlap

图4蛋白种类鉴定图

图5定量深度对比图

不难看出，SN17鉴定深度显著向下延伸，低丰度蛋白鉴定到更多，但增加的也不仅仅是极低丰度蛋白，不同数量级层面鉴定数目均有增加。

All proteins(SN17:7699;SN14:4926)

Proteins(Qvalue<0.05)(SN17:1639;SN14:1035)

图6蛋白定量相关性图

宏观上看，SN17与SN14在蛋白定量方面，不管是整体水平，还是经Qvalue过滤后的差异蛋白均保持高度相关，说明软件在更新过程中仍保证稳中求进的计算能力，提升了低丰度蛋白的检测灵敏度，而序列覆盖度的确没法更高了。

图6 重点差异蛋白展示

落实到具体单个差异蛋白表达量上，原文中所定量的差异蛋白质绝大多数都和SN17一致，同时验证的差异蛋白也和SN17定量一致，未出现偏倚。

基于《Blood》的单核细胞50例队列数据：

• SN17纵向对比SN14提升了56%的蛋白定量数量，227% 母离子定量数量。
  

• SN17横向对比DIA-NN提升了5%的蛋白定量数量，31% 母离子定量数量。

• SN17的定量缺失值显著少于DIA-NN、因此可靠的差异定量蛋白质数也有显著提升同时差异结果准确性也能够保证可靠（易算正在修回的一篇论文会进一步充分对比定量情况）。

2023开端，让Spectronaut17以稳健的数据解析能力、美观的可视化分析界面以及良好的用户交互体验成为您蛋白质组学路上的左膀右臂，三头六臂，陪伴您一起畅游DIA的谱图海洋，点亮从前难以发掘的黑暗角落！