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文章名称：Multi-omic Profiling of Multi-biosamples Reveals the Role of Amino Acid and Nucleotide Metabolism in Endometrial Cancer
样本类型：组织+ 尿液+ 宫腔内刷
涉及实验：蛋白组+ 代谢组
阅读理由：从通路的角度筛选标志物
关于文章
复旦大学乔亮课题组、复旦大学附属妇产科医院陈晓军团队，联合易算生物在Frontier Oncology（IF 6.2）发表了最新的研究成果。文章基于非靶向代谢组和非靶向蛋白质组研究，从组织样本中发现“子宫内膜癌”（EC）相关的重要通路，之后通过使用尿液和宫腔刷样本对这些关键通路进行验证，为将来可能的非侵入性或微侵入性活检诊断提供理论证据。
文章背景
子宫内膜癌（EC）是妇女最常见的癌症之一。当前常用的早筛标志物不具有癌症特异性，如血清癌抗原125（CA125）的增加是包括EC在内的多种类型癌症的标志物。寻找EC特有的生物标志物可以帮助以非侵入性或微侵入性的方式对该疾病进行早期筛查、诊断或术后跟踪。
本文通过多组学的方法找到EC标志物。文章的特色是从通路入手，对EC的代谢失调做出更可信的解释；结合蛋白质组学和代谢组学相互验证得到更加可靠的结果；结合多类型生物样本分析，得到EC相关失调通路更全面的信息。
图1 多组学分析流程图
在这项研究中，44名子宫内膜癌（EC）患者和43名正常对照组(Control)入选，收集子宫内膜组织（Tissue）、尿液（Urine）和子宫内刷（Intrauterine brushings）的样本。
* 对组织样本进行非靶向代谢组学和非靶向蛋白质组学分析，筛选到了关键的代谢物、蛋白，继而找到关键的通路。
* 对尿液和子宫内刷样本，进行非靶向代谢组学分析，基于组织样本获得的关键通路中选择代谢标志物，利用这些代谢物标志物建立模型，实现对EC的识别。由此，不仅对组织样本所得的结果进行了验证，还初步证明了利用尿液或子宫内刷代谢物诊断EC的可行性。
方法与结果
怎么找到EC标志物，继而证明这些标志物诊断EC的可行性？分三步。
1：组织样本的非靶向代谢组学和蛋白质组学分析
1.1 方法：组织样本通过非靶向代谢组学和蛋白质组学检测，找到差异显著的代谢物和蛋白，并通过多组学关联分析找到EC相关代谢失调关键通路
1.1.1 非靶向代谢组学分析流程
v 样本制备：取50mg冷冻组织，采取80%甲醇作为提取试剂进行研磨提取代谢物
v 数据采集：代谢物经T3 C18色谱柱进行有效分离，经QTOF质谱（SCIEX TripleTOF 4600）结合IDA模式进行正负模式数据采集
v 数据质控：采用待检测样本的pool样作为QC样本，每隔6个样本插入一个QC样本，根据QC样本的TIC一致性对仪器稳定性进行监控
v 组学分析：原始数据由MSConvert软件及R软件包XCMS处理形成矩阵格式，用于随后的统计分析。统计分析由MetaboAnalyst完成。PLS-DA模型中的VIP值和归一化峰强度的t检验的p值被用来选择显著差异特征，其规则为VIP>1或p<0.05。显著差异代谢物的鉴定由MetDNA基于精确分子量和二级谱图匹配进行定性分析。
1.1.2 非靶向蛋白组学分析流程
v 样本制备：冷冻的组织样本经研磨处理结合溶液酶解的方法进行肽段制备
v 数据采集：肽段经由Easy-nanoLC 1200色谱以120 min梯度进行高效分离随后经由Orbitrap Fusion Lumos质谱结合DIA数据采集模式进行数据采集。
v 数据质控：待检测样本中掺入iRT肽，通过QuiC软件实时监控色谱、质谱仪器的状态稳定性，包括保留时间、半峰宽、质量精度、信号强度等指标
v 组学分析：DIA的原始数据由Spectronaut（ver.14)）进行定性和定量分析，采用局部标准化进行样本间的归一化。经过Welch's ANOVA检测，筛选出p.adj值<0.05和倍数FC变化>1.5的不同表达的蛋白。
1.1.3 代谢组和蛋白质组数据进行多变量统计：使用MetaboAnalyst 5.0对代谢组和蛋白质组数据进行多变量统计分析，如主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）。
1.1.4 功能、通路分析：使用MetaboAnalyst 5.0进行代谢组数据的通路分析和富集分析。根据KOG数据库和GO注释做蛋白质的功能注释。差异代谢物和差异蛋白的网络分析使用MetaboAnalyst 5.0。
1.2 结果：检测到的EC患者和对照组之间的不同代谢物和蛋白，确定了EC相关的富集显著的通路。
通过PCA无监督分析发现EC组和对照组几乎不能分开，但通过监督分析，即PLS-DA（图2A），可以很明显将两个组区分。火山图（图2B）显示了上调和下调的代谢物分布。
用MetDNA识别到了74个差异代谢物。接下来为了描述不同代谢物的作用，使用MetaboAnalyst 5.0进行了KEGG通路分析，发现EC组织样本中差异代谢物高度富集的途径包括氨基酸代谢途径（如与酪氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸有关的代谢）、核苷酸代谢途径（嘧啶代谢和嘌呤代谢）、辅助因子和维生素的代谢途径（如CoA生物合成和生物素合成）等，其中大部分与能量代谢有关。
通过蛋白质组分析，找到1445个明显上调或下调（p.adj值<0.05和FC>1.5）蛋白。为了更深入地了解明显变化的蛋白质，应用KOG数据库进行功能分析。根据KOG的注释结果（图3D），差异蛋白主要分布在4个功能组：信号转导机制[T]，翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣蛋白[O]，细胞内贩运、分泌和囊泡运输[U]，以及转录[K]。除了4个最重要的功能组，这里还发现与能量代谢相关的几个功能。
因此，差异代谢物的路径分析和差异蛋白质的功能分析都强调了生物能量过程的作用，特别是与氨基酸和核苷酸有关的过程，显示了代谢组和蛋白质组数据之间的一致性。
2：通路分析，整合组织样本的代谢组和蛋白质组数据
2.1 方法：针对组织样本，对差异代谢物和差异蛋白质进行了cytoscape网络分析以识别其相互作用, 结合网络分析结果、不同代谢物的通路富集结果和不同蛋白质的功能分类结果识别关键通路。
2.2 结果：定位到了氨基酸代谢和核苷酸代谢等13条通路。
选择了拥有差异性代谢物之间直接转化，或差异性代谢物和差异性蛋白质之间直接相互作用的途径来进一步解释。共选择了13条途径，即丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的代谢，精氨酸和脯氨酸的代谢，精氨酸的生物合成，色氨酸的代谢，苯丙氨酸等代谢。
与TCA循环相关的能量代谢的重要途径和差异性代谢物和蛋白
图4 与TCA循环相关的能量代谢的重要途径和差异性代谢物和蛋白
3：使用尿液和宫内刷样本验证重要的途径
3.1 方法：对于尿液和宫内刷样本启动分析。
3.1.1 基础分析：非靶向代谢组学分析、数据处理和结构鉴定的方法与组织样品相同。
3.1.2 标志物分析：代谢组生物标志物分析使用MetaboAnalyst 5.0进行。利用多变量探索性分析，通过基于PLS-DA算法的ROC曲线分析来测试模型的性能。ROC曲线由MCCV生成。在每个MCCV中， 2/3 的样本被用来计算特征重要性（feature importance）。然后，前2、3、5、10......100个（最大）重要特征被用来建立分类模型，并在剩下的1/3样本上进行验证。这个过程被重复多次，以计算每个模型的性能和置信区间。
3.2 结果：基于通路中获得的相关代谢物有良好的分类性能，且具有特殊趋势。
3.2.1发现1 ：利用尿液或子宫内刷代谢物诊断EC显示出良好的分类性能。
根据组织样本中筛选的13条途径，分别识别了285个尿液代谢物和122个宫腔刷代谢物，从这里面筛选用于对EC患者和对照组进行分类的标志物。PLS-DA被用来作为分类方法以生成接收器操作特征（ROC）曲线（图5B和5C）。
对于尿液样本：选择前100个代谢物的曲线下面积（AUC）最高，为0.808，但当选择的顶级代谢物数量从5个到100个改变时，AUC值没有太大变化（图5B）。结果表明，尿液中与组织样本分析所选择的13条途径有关的代谢物可以作为识别EC的潜在生物标志物，而且基于前几个重要代谢物的模型显示出良好的分类性能；在基于100个特征模型的交叉验证过程中，尿液代谢物被选择的频率最高的代谢物被展示（在前15名中，频率≥0.94，图5D ）。与对照组相比，大多数重要的代谢物在EC患者的尿液样本中下调。
对于宫内刷样本：AUC值随着所选代谢物数量的增加而增加，在选取100个代谢物时，AUC值最高，达到0.847（图5C）。该结果表明，对于宫内刷样本，少量代谢物（5~25）不足以建立分类模型。在基于100个特征模型的交叉验证过程中，一些重要的宫腔刷代谢物被最频繁地识别（在前25个中，频率=1.0，代谢差异展示如图5E）。
3.2.2 发现2：比较了组织、尿液和宫腔刷样本中不同代谢物的上调和下调情况，有趣的是，子宫内刷中代谢物的调控显示出与子宫内膜组织相似的趋势，而尿液中代谢物的调控则显示出与组织相反的趋势。
为了比较组织、尿液和宫腔刷的代谢组变化，选择从组织样品中识别出的74种重要的代谢物，并比较了三种类型样品之间代谢物变化的规律。图6显示了EC患者和对照组之间的log2（FC）值的热图。在74种代谢物中，47种在组织样本中上调，27种下调。其中49个代谢物在尿液中也被检测和鉴定，6个上调，43个下调，与组织代谢物相比，总体呈现相反的趋势。74种代谢物中的21种在宫内刷样本中被检测到，其中9种上调，12种下调。与组织代谢物相比，总体上显示出一致的趋势。
宫腔刷与组织关系更密切，而尿液是经几个器官代谢后非常下游的生物液体。相反的趋势也可能与一种假设有关：即肿瘤中的异常代谢可能导致代谢物在病灶中的积累，从而降低它们在尿液中的浓度。
所有的分析都证明了氨基酸代谢和核苷酸代谢在EC中的重要性，再次印证了组织样本分析得出的结论。
文章结论
1、仅仅通过单一的组学分析，很难确定EC中真正改变的代谢途径。
2、本文通过使用多组学、多生物样本证明了氨基酸代谢和核苷酸代谢在EC中的重要作用，并说明了代谢物和蛋白质之间以及代谢途径之间的网络互动。同时，通过使用尿液和宫腔刷样本的代谢组学分析，为无创或微创的EC诊断提供了支持性证据。
3、用于建立分类模型的代谢物并不是直接通过机器学习从尿液和子宫内刷的代谢组学数据中选择的，而是借助了通路知识，因此寻找生物标志物并建立可靠的分类模型也是通路分析未来的重要方向。
4、利用尿液或子宫内刷样本中所获得的代谢生物标志物，具备进行非侵入性或微侵入性活检诊断EC的潜力。
作者贡献
本推文根据易算参与的科研项目做解读，并得到了乔亮教授的指导修改。最后，我们希望通过这篇文章来纪念我们永远的导师杨芃原教授。
关于组织、尿液、血液蛋白质组、代谢样品，从预处理到数据分析，易算有一套完整且快速迭代的工具箱。如果你也想尝试多组学研究，或者想合作挖掘临床组学数据，欢迎致电或留言。
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Matthias Mann综述文章精读：人工智能如何用于蛋白质组学和生物标志物的新发现
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