HUPO海报搬运 | 自动化样品制备与短梯度 LC-MS 采集相结合加速蛋白组研究
在刚结束的HUPO 会议上，几张海报让大家对短梯度 LC-MS 的应用有了更多了解，今天我就来和大家分享这些内容。
海报1：自动化样品制备与短梯度 LC-MS 采集的高效整合
团队采用了自动化样品制备结合短梯度 LC-MS 采集技术，在提高通量的同时确保数据的深度和精度。
自动化处理单次运行最多并行两个 96 孔板，大幅提升样本制备的效率和通量；这次采用17 分钟的非线性液相色谱梯度，约每天可 38 个样本处理能力，相比传统的 1小时甚至更长的梯度时间，这个时间显著提高了每台仪器的采集效率。
短梯度采集结合自动化样品制备使得实验室的整体处理时间和人工干预显著减少。例如，团队对 10 种不同的人类细胞系（3技术重复，总体 n = 30）进行了处理，整个过程从样本准备到质谱采集共用时 31 小时，这种短梯度方案使得每月可处理和采集约 1000 个样本，使用 Bruker timsTOF HT 系统对样本解析。
从实验结果来看，短梯度的使用并没有牺牲数据的深度和覆盖率。研究团队在10 种不同细胞系 中，成功鉴定了 11789 个unique PG和 223,000 个肽段，平均每个样本 鉴定 9547 个PG，整体的样本回收率达到了 97.3%。
数据的重复性也OK，比如说中位变异系数 (CV) 为 7.9%，其中 87% 的PG CV 低于 20%，这些指标表明短梯度的方案依然可以高质量且一致性良好。
这种新的工作流程还支持深入的生物学研究应用。例如短梯度 LC-MS 采集也能够全面覆盖像表皮生长因子受体（EGFR）这样的已知药物靶标，通过比较 EGFR 蛋白中特定肽段（NYVVTDHGSCVR）的强度，进一步验证了不同细胞系中特异性的蛋白表达的不同。
表皮生长因子受体（EGFR）分子的三维结构图，红色显示已识别的肽。蛋白质总序列的 48%被覆盖到。
除了17 分钟短梯度，这次研究中还展示了短梯度方案在其他场景的应用，包括 45 分钟的梯度方案，特别是在药物靶标筛选方面的使用。
海报2：短梯度 LC-MS 与 LiP-MS的结合用于药物靶标识别
LiP-MS是一种通过限制性酶水解来捕捉蛋白质在药物结合后的构象变化来识别靶标的方法。蛋白质的结构在药物结合前后可能会发生变化，这些变化会影响酶的切割位置。当蛋白质与药物结合时，可能会发生构象变化或物理上的阻挡，使某些部位变得更难被酶切割，或者让某些部位变得更容易切割。
整个过程分为以下几个步骤：将细胞裂解液与不同浓度的药物进行处理；使用特定的酶对蛋白质进行部分切割，观察药物是否使蛋白质的结构发生变化，从而影响酶的切割；随后，再用胰蛋白酶对蛋白质消化生成短的肽段；使用DIA质谱方法来分析这些肽段。通过比较这些肽段来判断蛋白质是否因为药物的结合发生了构象变化。
传统的 LiP-MS 由于复杂、费时且低通量，难以适应大规模药物筛选的需求。因此，他们这次引入了 自动化样品制备 和 短梯度 LC-MS，显著提升了通量和效率。
设计完整的自动化样品制备工作流程，能够从样本输入直接生成适合质谱分析的多肽。可以无缝集成前后处理方法（如血浆去高丰度或者说 SIS 加标），最终以 96 孔板式 输出样品，直接用于 LC-MS 分析。方案采用了45 分钟的液相色谱梯度，结合 DIA-PASEF采集方法。
自动化样品制备的性能提升：样品处理通量提高了四倍，手动操作时间减少了 70%，并将肽段水平的变异系数（CV）降低了 6% 以上； 短梯度 LC-MS 高效采集：短梯度 dia-PASEF 方法实现了快速采集，同时不影响化合物主要靶标的识别； 结合自动化样品制备和 LC-MS 采集：在一周内可评估多达 7 种化合物。
使用 磷酸酶抑制剂CALYCULIN A对目标蛋白进行分析，成功捕捉到药物结合引起的蛋白质构象变化（图中的颜色梯度显示了由 LiP-score 测量的因结构变化引起的可能性，颜色越深表示发生结构变化的可能性越大）。这一过程通过短梯度 LC-MS 快速完成，数据精度和分辨率都得到了保证。
总结
短梯度 LC-MS 在蛋白质组学和药物靶标研究中展现了非常高的应用价值。17 分钟和 45 分钟的短梯度方案大大缩短了采集时间，期待未来这些创新的应用能够继续带来突破。
继续了解
SpectroDive™12：带着AI和超多实用功能强势来袭！
View期刊｜易算高通量、自动化、机器学习方案助力大规模样本标志物筛查
关于我们