【IF 18.361】未来的生物标志物：LiP–MS引领帕金森病蛋白质组从结构到分子机制的探索
发表期刊：nature structural & molecular biology
技术特色：limited proteolysis–mass spectrometry (LiP–MS），通过限制性蛋白质水解（limited proteolysis）和质谱分析（mass spectrometry）来研究蛋白质的结构和功能（文章末尾有具体实验细节）
技术场景：本文着重强调了通过限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）识别新型结构生物标志物的重要性。LiP-MS成功地在PD患者 VS 健康群体中识别了76个结构改变的蛋白质。其中包括在PD中已知的结构改变。进一步进行biomarker的识别，发现从结构角度比蛋白质丰度数据更好地区分了PD个体与健康个体。
技术意义：LiP–MS提出了一种新生物标志物发现范式，强调了解析病理过程中蛋白质结构的重要性。与其他可能侧重于表达水平或特定修饰的生物标志物方法不同，LiP–MS强调蛋白质在人类CSF中的结构变化能更好地区分健康个体和PD患者。可能为个性化治疗和诊断开辟新途径。
一 实验设计
研究对象：帕金森病（PD）的个体（PD组）,以及健康个体（HG）。
临床数据收集：对于PD组，收集了临床指标定量值，并且之前已经收集了完整队列的PD相关生化标志物水平（总α-突触核蛋白、磷酸化α-突触核蛋白和寡聚α-突触核蛋白）。CSF样本通过腰椎穿刺采集。
样本处理（a图）：图中显示了CSF样本的处理过程。 每个样本分成两份：一部分进行限制性蛋白水解（LiP）后进行胰蛋白酶消化，然后进行质谱分析，用于识别蛋白结构改变；另一部分仅进行胰蛋白酶消化用于测量蛋白质丰度和可能由共价修饰（如PTM）或肽序列变化（来自可变剪接、RNA编辑、内源性蛋白水解或突变）引起的肽水平变化。
数据分析与应用（b图）：识别健康个体CSF中的可变肽段，即找出正常健康人群中CSF蛋白质结构的可变性；识别健康个体与PD患者之间有差异的结构生物标志物肽段，即找出与PD关联的特定结构变化，这可能有助于PD的诊断或理解其生物学机制。
二、健康人群脑脊液（CSF）中蛋白质结构可变性
通过比较健康样本中LiP肽段和仅用胰蛋白酶的肽段intensity， 以及评估每个肽段的可变性分数用以度量结构变化导致的LiP肽段强度的变化。有助于理解蛋白质结构如何在健康人群中变化，以及这些变化可能与什么功能和特性有关。
主要发现：
蛋白质结构的可变性：
发现蛋白质结构的可变性信号，除了蛋白质丰度的可变性。
117个肽段被归类为结构高度可变，来自64个独特的蛋白质（约占6.5%的检测到的CSF蛋白质）。
这些结构可变的蛋白质涉及各种细胞和神经功能。
可变肽段的特性：
高度可变的肽段区域倾向于形成α-螺旋而不是β-折叠。
所有可变肽段都有更高的倾向于与其他蛋白质结合。
高度可变肽段的蛋白质展示了更多相互作用的结构特征。
可变蛋白质区域的预测无序得分显著高于非可变区域。
a：这张图对比了蛋白酶K（LiP）和胰蛋白酶（trypsin）的肽段强度。每个点表示一个肽段。红线和橙线分别表示高度可变和中度可变肽段的截止标准。可以看作是一种用于衡量蛋白质稳定性的标准。
b：火山图展示了肽段的变异分布。红点、橙点和灰点分别代表高、中和低变异的肽段。Levene's test的P值用来衡量这些变异的统计显著性。
c：盒图显示了不同肽段类别的SCRIBER分数。这有助于了解哪些肽段在结构上有显著差异。
d：展示了肽段的Disopred3无序得分，有助于了解哪些肽段结构相对松散或有序。
e：这张图比较了高度可变肽段中具有双峰和非双峰LiP强度分布的肽段的Disopred3分数。这有助于了解这些高度可变肽段的结构特点。
f：展示了特定肽段的LiP强度和胰蛋白酶强度的分布。每个点代表一个样本。
g：3D结构图显示了人脑果糖-1,6-二磷酸醛缩合酶的一个亚基。图中还展示了与肌肉异构体的配体结合的结构。
h：展示了另一高度可变肽段的LiP强度与胰蛋白酶强度的分布，每个点代表一个样本。
i：3D结构图显示了semaphorin 7A的结构，并与Plexin C1复合。图中不同颜色的区域表示不同可变性的肽段。
三、蛋白质在帕金森病患者脑脊液中的结构变化
为了找到健康个体和PD患者的CSF之间结构改变的蛋白质， 使用多元线性回归来预测三种类型的数据，包括LiP肽段强度（反映结构变化）、仅用胰蛋白酶的肽段强度（反映蛋白修饰）和蛋白质丰度变化。在线性回归模型中，还考虑了年龄、性别以及其他技术因素，如总蛋白浓度和批次效应。
有以下主要发现：
帕金森病的结构变化：分析显示结构变化与PD状态更相关，而不是蛋白修饰或蛋白质丰度。
性别与年龄的影响：
性别：没有检测到男性和女性之间的重要蛋白质结构差异。
年龄：检测到随着年龄增长脑脊液中的蛋白质结构变化。
结构生物标志物：从859个蛋白质和7144个肽段中，选出了88个LiP肽对应76个蛋白质，作为潜在的结构生物标志物。
其中2种蛋白质与PD关联基因有关。
通过功能富集分析，发现这些结构改变的蛋白质与已知的PD机制有关，例如与突触功能障碍和丧失相关的术语。
a 如何识别脑脊液（CSF）中的结构肽段变化、与蛋白酶K（PK）无关的肽段变化和蛋白质丰度变化。这个图展示了如何分析数据并区分这三种变化。
b. 结果直方图（CSF数据分析）展示了CSF数据分析的结果，通过颜色可视化三种线性模型系数的t统计量的P值。蓝色代表基于结构变化的效应，浅绿色代表基于与PK无关的肽段变化的效应，深绿色代表基于蛋白质丰度变化的效应。最左边的柱表示显著的P值（P<0.05）。
c. 结果直方图（年龄、队列和性别变量）同样展示了CSF数据分析的结果，但这次是针对年龄、队列和性别变量的P值，通过颜色区分。蓝色代表基于队列成员资格的效应，洋红色代表年龄，黄色代表性别。显著的P值与b图中相同。
d. 各肽段的系数图显示每个肽段的系数与对应的P值的关系，应用了P值校正（Benjamini-Hochberg）。每个点代表一个单独的肽段；蓝色表示在健康和PD队列组中CSF内有差异的候选生物标志物肽段。
e. GO术语分析图 对应于图d中的候选生物标志物肽段的蛋白质的GO术语分析。
f. 脑部数据分析的直方图与图b类似，但对应于脑部数据的分析。颜色和显著P值与图b中相同。
因此这里展示了复杂的分析结果，旨在识别健康人群与帕金森病（PD）患者之间脑脊液中的蛋白质结构变化。通过线性模型、直方图和其他可视化方法，研究人员可以理解和比较不同变量的效应，从而可能找到与PD相关的生物标志物。
除了CSF这种体液，文章也分析了PD患者脑部的蛋白结构变化以及联合分析脑脊液和大脑中的蛋白结构变化，揭示了PD中与疾病有关的特定蛋白的结构改变。接下来详细讲解。
四、探索帕金森病（PD）脑脊液（CSF）和大脑中蛋白结构的改变
这里采用了组织与体液结果的联合分析，目的是了解这些改变与疾病之间的关联。
方法
筛选蛋白：选择在PD的CSF和大脑中结构发生改变的蛋白，以便与病理过程的关联。
识别结构变化蛋白：鉴定了16个此类蛋白，深入研究其结构改变。
结构与功能分析：通过映射改变的肽段到3D蛋白结构，推测健康和疾病状态之间的功能变化。
主要发现
特定蛋白的结构改变与PD关联：鉴定了16个在PD的CSF和大脑中结构发生改变的蛋白。这些蛋白与调控神经递质信号、Lewy体的组成以及PD样表型等有关。
蛋白结构的改变可能反映功能的改变：例如，CBLN1的结构变化可能反映突触的完整性和可塑性的改变。
PD与维生素D缺乏的关联：观察到维生素D结合蛋白（GC）的结构变化，可能与维生素D（钙三醇）的结合有关。这与PD患者的维生素D缺乏及其与运动症状严重程度的关系一致。
结构变化与疾病机制的关系：这些结构改变可能与病理过程有关，为未来的机械研究提供线索。
a：NrCAM（神经细胞黏附分子）的肽段覆盖图，用于比较CSF（上）和大脑（下）的样本。黑色表示分析的所有肽段；红色表示PD和健康样本之间显著改变的结构肽段。深灰色和浅灰色分别突出Ig样和纤维连接蛋白第III型域。
b, c：PITH1的AlphaFold预测结构，根据CSF（b）和大脑（c）数据的肽段进行着色。肽段颜色与a图相同。
d：PITH1的CSF（上）和大脑（下）的肽段覆盖图。颜色与a图相同。
e, f：三聚体CBLN1的结构（e）和肽段覆盖图（f），根据CSF数据的肽段进行着色。灰色表示半胰蛋白酶肽段。
g：CBLN1指示肽段的健康个体和PD患者的标准残差。箱线图展示了中位数、四分位数和异常值。
h：维生素D结合蛋白GC（带有黄色的维生素D）的结构，根据原位CSF数据的肽段进行着色。
i：GC在CSF中的肽段覆盖图。浅蓝色框表示改变的结构肽段的蛋白区域。
j：GC指示肽段的标准残差，与g图相同。
k：维生素D结合蛋白的结构（与h相同），根据体外添加底物（钙三醇）后发生变化的肽段进行着色。红色表示显著改变的肽段。
l：k图中显著肽段的覆盖图。
这些图像共同展示了在PD患者的CSF和大脑样本中观察到的蛋白质结构变化。通过比较肽段覆盖、结构预测和标准残差分析，研究人员能够识别与PD有关的特定结构变化，从而提供关于疾病机制和可能的生物标志物的深入见解。
五、使用结构肽段组合来区分健康个体与帕金森病患者
研究的主要目的是确定是否可以通过使用结构肽段组合来区分健康个体与帕金森病（PD）患者，因为生物标志物组合可能增加诊断的灵敏度和特异性。
方法
五折交叉验证：我们把数据分成五份（称为折叠），确保健康和PD样本在每一份中均匀分布。每次使用四份作为训练数据，一份作为测试数据。这样做五次。
选择特征：从样本中选择某些肽段（peptides），它们在所有样本中都有测量，并且在不同组别（例如健康和PD）之间有显著差异。
构建模型：使用上述特征，通过线性模型训练了一个名为LiP的模型，该模型可以预测肽段的强度变化。从训练数据估计候选生物标记肽段的缩放残差（scaled residuals）。
LASSO回归：使用缩放残差构建逻辑回归LASSO模型，用于分类健康和PD样本。对于缺失的值，我们使用平均值来填充它们。
选择参数：通过尝试不同的选项和交叉验证找到最佳的正则化参数λ。如果不能选择满足5或10个预测变量的模型，则选择最接近的选项。
多次测试：这个过程被重复五次，并且整个五折划分也重复了五次，共产生25个模型。
组合模型：将具有相同预测变量数量的模型得分平均，导致加权集成方法。
其他模型：除了基于肽段的模型，还尝试了其他模型，包括基于α-突触核蛋白比率的模型、仅使用胰蛋白酶强度的模型等。
防止过拟合：通过确保模型性能仅使用未用于模型估计的数据或样本来评估，我们避免了过拟合的问题。此外，使用相同肽段集合训练的模型，所以任何因肽段数量造成的过拟合都会在两个模型中预期。
主要发现
性能优越：结构改变的模型优于非结构改变的模型（AUC分别为0.752, 0.675, 和0.673）。
结构与丰度分析：结构与丰度的组合模型仅略微增加了区分能力。
与现有生物标志物比较：基于LiP肽段的分类略优于总α-synuclein，但不如寡聚体α-synuclein或寡聚体与总α-synuclein的比率。
组合效应：α-synuclein和LiP肽段的组合大大提高了整体准确性（达到91%）。
误分类分析：α-synuclein模型误分类了12个PD患者，而LiP模型则有更高准确率。
a, 分析工作流程示意图：这一部分展示了如何对样本进行分类的工作流程，以确定其是否属于PD（帕金森病）或健康。
b, 基于LiP肽变异的PD分类的接收者操作特性曲线（ROC曲线）：这个图展示了使用LiP肽变异进行PD诊断的效果。ROC曲线是用来衡量分类模型性能的图形工具。曲线下的面积越大，模型的准确性越高。
c, 基于PK独立肽变异的PD分类的ROC曲线：这个图展示了基于与蛋白激酶无关的肽变异进行PD诊断的效果，作为另一种分类方法的效能展示。
d, 基于仅胰蛋白酶蛋白丰度的PD分类的ROC曲线：这个图展示了仅使用胰蛋白酶蛋白丰度来诊断PD的效果，显示这种方法的效能。
e, 使用寡聚体与总α-突触核蛋白的比率和使用五个LiP肽水平的分类比较：每个点代表一个个体，颜色表示队列归属。x轴表示α-突触核蛋白的寡聚体与总体的比率，y轴表示五个LiP肽的水平。低于零的log（odds）被分类为健康，高于零的被分类为PD。每个象限中的数字表示分类的结果。
这些图形从不同方面支持了一个观点：蛋白结构变化比蛋白丰度信息更能提供有关PD状态的信息。此外，全CSF蛋白组的结构分析可能确定与现有基于α-突触核蛋白的测量互补的PD生物标志物，这些可以与现有测量结合以提高识别疾病患者的能力。
六、LiP–MS实验安排
LIPS-MS结合了限制性蛋白水解（Limited proteolysis, LiP）和液相色谱质谱（LC-MS）技术。在LiP阶段，蛋白酶用于部分消化蛋白质，只剪切蛋白的一些部分，而不是完全剪切。结合LC-MS可以对这些部分进行深入分析。
样本准备
脑脊液样本准备
解冻样本：样本在冰上解冻，分为七个批次。
蛋白浓度测定：使用Pierce BCA Protein Assay Kit测定蛋白浓度。
样本分割：每个样本分为trypsin-only样本和LiP样本，每个样本含80µl CSF。
加热和水解：样本加热至25°C，再向LiP样本中加入Proteinase K进行水解。
停止消化和后续处理：样本加热至95°C停止消化，然后冷却并添加化学试剂进行后续处理。
脑组织样本准备
解冻和转移样本：样本在冰上解冻并转移到1.5-ml管中。
组织匀浆和离心：使用冷却的匀浆缓冲液和匀浆机进行组织匀浆，然后离心。
样本分割和消化：与脑脊液样本的处理相同。
液相色谱质谱分析
数据依赖采集（DDA）
库生成：通过高pH反相分级分离样本，并在某些条件下选择某些离子进行分析。
色谱分离和质谱设置：使用特定的色谱柱、流动相和质谱仪设置进行样本分离和分析。
数据独立采集（DIA）
DIA模式：使用与DDA类似的LC-MS设置，但在质谱分析中采用DIA模式，系统地采集所有离子的数据。
窗口宽度调整：根据前体密度调整窗口宽度。
数据分析
混合库生成：使用SpectroMine软件对DDA和DIA原始文件进行搜索，并按1% FDR生成库。
DIA数据分析：使用Spectronaut软件分析htrms文件，并使用先前生成的混合库。
脑样本的LC-MS方法
库生成和DIA分析：与脑脊液样本的方法类似，但使用不同的色谱柱和质谱设置。
七、LiP–MS应用的优势总结
蛋白质结构分析的新途径：这项研究不是简单地查看蛋白质的数量，而是分析它们的结构如何改变。通过分析人脑脊液（CSF）中蛋白质的结构变化，更能有效地区分健康人和帕金森病（PD）患者。
结构生物标志物的概念：传统的生物标志物通常基于蛋白质的数量。这项研究提出了一种新的基于结构的生物标志物，可能比基于蛋白质水平的标志物更精确。
更好的诊断性能：结合结构性信息，其准确率高达91％，显著优于仅使用传统方法（准确率75％）。
捕捉疾病途径：该分析揭示了PD中涉及的特定途径，如突触组织的改变，为深入了解该疾病提供了新的视角。
全局健康人的结构蛋白质组分析：首次对健康人的CSF中的结构蛋白质组进行全局分析，为未来的生物标志物开发提供了基础。
广泛的潜在应用：这种分析蛋白质结构的方法不仅限于PD。例如，它也可能用于捕捉癌症中改变的蛋白质结构，为了解人类疾病提供了全新工具。