LiP-MS结果解读
LiP-MS作为一种蛋白质组学技术，其结果需要从肽段层面和蛋白/结构层面两个角度来理解。
LiP-MS（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry）是一种用于研究蛋白质结构变化的蛋白质组学技术。就是利用蛋白质对蛋白酶的敏感性变化，来发现蛋白质结构在不同情况下是如何发生改变的。
具体怎么做呢？
首先，把细胞或组织里的蛋白在比较温和的条件下，用一种比较“挑剔”的蛋白酶（例如蛋白酶K）进行“有限酶切”。这种酶只切割蛋白质中那些比较暴露、容易接近的区域。如果蛋白质因为药物结合、病变或修饰发生了结构改变，那么这些区域可能变得更加紧密（不易被切割）或者更加松散（更容易被切割）。
接下来，再用常规的胰蛋白酶把蛋白质彻底切碎，用质谱仪检测蛋白片段（肽段）的数量差异。
通过比较处理前后的肽段变化，我们就能清楚地知道哪些区域发生了构象改变。这些因结构变化而产生数量差异的肽段，就是所谓的“LiP肽段”。
doi: 10.1038/nprot.2017.100. Epub 2017 Oct 26.
所以，LiP-MS并不是直接看蛋白质的量变没变，而是看蛋白质的“形状”变没变。比如药物作用机制、疾病相关的蛋白结构变化，以及一些传统方法难以发现的蛋白靶点。
常以表格列出显著变化的肽段及其信息，例如肽段、序列、所属蛋白、肽段的位置或长度，以及在两种处理条件下的丰度比值（Fold Change）和统计显著性值（如p值）。
通过fold change可以看出肽段在处理组相对对照组是上调还是下调。例如，如果某肽段在处理条件下丰度显著升高（比如Fold Change > 1.5，且具有统计学显著性），则表示这个肽段在处理条件下变多了，即该区域更难被蛋白酶切割（可能被保护起来）因而在有限酶解后积累更多。反之，丰度降低的肽段可能表示肽段变少了，即对应区域更容易被切割（暴露出来了）。
Ceccacci S et al. (2024) A label free chemoproteomic platform to disclose cannabidiol’s mechanism of action in CML cells.
DOI: 10.1016/j.heliyon.2024.e24196
也会有一些研究会额外提供肽段类型（Peptide type），即全酶切和半酶切：
Measuring protein structural changes on a proteome-wide scale using limited proteolysis-coupled mass spectrometry
Nat Protoc . 2017 Nov;12(11):2391-2410.
doi: 10.1038/nprot.2017.100. Epub 2017 Oct 26.
全酶切肽段（fully-tryptic）：两端均为胰蛋白酶特异切割位点，仅来源于常规胰蛋白酶消化，提示该区域在限域酶切条件下未被非特异性酶接触切割。Fully-tryptic 丰度上升意味着限域酶切割区被保护，结构更紧密，不易被非特异性酶接触切割。
半酶切肽段（half-tryptic）：一端为胰酶切割位点，另一端为 Proteinase K 等非特异性酶切割位点，提示该区域在限域酶切过程中暴露于溶液、可被非特异性酶切割。half-tryptic 丰度上升意味着限域酶切割区更暴露，构象相对松弛或存在构象变化，增加了非特异性酶的切割可及性。
在 LiP-MS 的真实解读场景里，如果你的目标就是看结构（而不是讨论表达丰度），先把差异肽段表整理好——肽段序列、所属蛋白、起止位置或长度、肽段类型（fully/half）、Fold Change 和显著性都列出来；
接着先看胰酶对照（只用胰酶、不加 Proteinase K）：这里要对照稳定---指两件事同时成立——一是实验组和对照组之间比较没有明显差异，二是组内重复不飘（波动不大、缺失不多）；只要哪一头不稳，都更像是丰度在变，先别把它当成结构信号；
当对照稳定时，再进入结构判读，而且只在同一蛋白的同一局部比较（序列要重叠或至少紧挨着）：如果看到 half-tryptic 上升而 fully-tryptic 下降，更像暴露增强；如果 fully 上升而 half 下降，更像受保护增强；若两类肽段同向变化，或者根本不在同一局部，就把它记作丰度/消化差异，暂不作结构层面改变的讨论。
按这条线把表格做过滤，出来构象变化的肽段，并据此汇总出构象改变的蛋白列表。
由于一个蛋白可能对应多条发生变化的肽段，研究会汇总每个蛋白的变化情况。例如，一个蛋白有多段肽呈现显著差异，则该蛋白被认为发生了构象变化。在文章中往往将这类蛋白称为构象异变蛋白或构象改变蛋白。许多结构变化并不伴随蛋白含量改变，是LiP-MS独特捕捉到的信息。
横轴通常是肽段丰度变化的对数倍数（对数Fold Change），纵轴是显著性（-log10 p值）。每个点代表一个肽段（或汇总到蛋白级别），显著变化者会位于图的上方两侧。通过火山图，可以快速识别哪些肽段/蛋白有显著的构象变化。
比如下图火山图显示很多点在上方偏右，说明有大量肽段在处理条件下丰度升高（受保护）；偏左则表示处理引起更多切割（肽段减少）。
真正做这张图的时候要讨论更多细节内容就不在此展开。LiP-MS 火山图比的是哪一段更容易被切、哪一段更难被切，而不是简单的表达上下调了。
LiP-MS提供的是蛋白质结构层面的信息，很多文章会在图中将显著变化的肽段映射回蛋白质序列或结构域示意图，高亮出LiP-MS发现的“受影响区域”。
例如，某些疾病或药物作用的研究可能通过LiP-MS发现新的蛋白构象变化，并发现它们富集于全新的信号通路或代谢途径，从而提示了可能的疾病机制或药物作用机制。获得富集表格以后往往会做成气泡或者条形图、网络图来展示。
Mapping Conformational Changes in the Saliva Proteome Potentially Associated with Oral Cancer Aggressiveness |Journal of Proteome Research 2024, 23, 6, 2148-2159 (Article)
DOI: 10.1021/acs.jproteome.4c00093
比如通过研究发现，通过LiP-MS得到的构象改变蛋白富集于15个独特的生物学过程，其中一些过程是传统定量蛋白质组未能显现的。相比之下，常规蛋白丰度差异分析只发现了11个富集过程，主要与免疫相关。这类分析表明LiP-MS能够揭示不同条件下独特的生物学响应，超出单纯表达水平变化的范畴。
首先通过初步筛选找到CBD处理可能结合的蛋白；
用LiP-MS确认这些蛋白中哪些区域（肽段）发生了结构变化；
再结合火山图快速锁定变化最显著的肽段；
在蛋白结构示意图上标出这些区域，确定CBD结合的具体位点；
最后通过分子对接或其他实验确认机制。
例如，Ceccacci等2024年CBD研究发现CBD处理后，剪接因子EFTUD2的特定结构域（GTP结合域和Domain III区域）发生了显著保护（丰度增加），结构变得更紧密，从而提出CBD通过稳定该蛋白的结构来发挥抗癌作用，这种机制与传统CBD认知不同。
LiP-MS作为一种蛋白质组学技术，其结果需要从肽段层面和蛋白/结构层面两个角度来理解。
因此，当看到LiP-MS结果的表格与图时，一是差异肽段/蛋白名单及其统计意义，二是这些差异在结构上的分布与可能的作用机制。掌握了这些要点，就能读懂LiP-MS论文中的图表所传递的生物学信息。
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