文章题目：A machine learning-based chemoproteomic approach to identify drug targets and binding sites in complex proteomes：一种基于机器学习的化学蛋白质组学方法，用于识别复杂蛋白质组中的药物靶标和结合位点
DOI: 10.1038/s41467-020-18071-x
研究背景
药物靶标发现策略的现状与局限性：药物开发中的一个重大挑战是揭示小分子的作用机制和分子靶点。近年来，一些蛋白质组学方法使得研究天然环境中的蛋白质-药物相互作用成为可能，比如基于化学修饰探针或基于蛋白质稳定性的药物靶点发现策略。然而前者的靶捕获探针可能会干扰分子相互作用和生物功能，后者由于缺乏富集步骤，可能无法检测到最低丰度的蛋白质靶标。因此，药物靶点表征仍然是一个挑战，尤其缺乏的是不需要药物标记的方法，以及在肽水平分辨率识别药物结合位点的方法。
解决方案：为了解决这一限制，本文开发了LiP-Quant，这是一种基于有限蛋白水解和质谱的药物靶标全局检测方法，同时采用了基于机器学习的框架，即利用药物多浓度剂量来识别药物靶标，并提供结合位点预测和靶标亲和力。
名词解释
LiP-MS：有限蛋白水解质谱法。检测天然细菌，酵母和哺乳动物系统中蛋白质组范围内的代谢物-蛋白质和药物-蛋白质相互作用。由于药物结合靶标蛋白后产生位阻变化，使得其无法被限制性蛋白酶（如蛋白酶K）酶切（LiP），这将与非药物处理的样品形成差异肽段，通过LC-MS在蛋白组范围内全局检测全酶切及半酶切肽段的信号强度变化，进而找到潜在的药物靶标及其结合肽段。
LiP-SMap：由LiP-MS发展而来的实验和分析工作流程，利用药物单浓度剂量来全局鉴定药物靶标。值得注意的是，这一方法更适用于研究低复杂度蛋白质组（如微生物）中的药物靶标鉴定。
LiP-Quant：LiP-Quant采用了基于机器学习的框架，即利用药物多浓度剂量来识别药物靶标，并提供结合位点预测和靶标亲和力。适合识别复杂真核生物蛋白质组(例如人类)中的药物靶标。
研究结果
1. LiP-SMap鉴定人类药物靶点
首先，本文用药物雷帕霉素测试了LiP-SMap在天然人类细胞环境中的适用性（已知雷帕霉素仅与一种靶标蛋白FKBP1A相互作用）。
实验策略：HeLa细胞裂解物和HeLa活细胞（两种样本类型），均设置加药和不加药处理（2µM雷帕霉素）。然后，对蛋白质组提取物进行LiP-MS分析。这里质谱方法采用DIA技术鉴定有无药物处理的差异蛋白水解肽段。
实验结果：从HeLa细胞裂解液中定量了5265蛋白，从HeLa细胞中定量了6068蛋白，其中确定了52个潜在的药物靶点，并且在裂解物和活细胞中都有已知靶点FKBP1A ( q-value = 0.0001, FC = 1.5)。然而实验还发现了FKBP1A之外的靶标，因此这种单一药物剂量的工作流程可能无法明确区分真正的蛋白质相互作用物和假阳性鉴定，这可能是由于人类蛋白质组的高度复杂性，因此需要在这些潜在靶点中确定优先级。
2. LiP-Quant通过机器学习识别药物靶标
样本策略：采用HeLa细胞裂解物，因为靶蛋白和配体之间的直接物理相互作用在细胞提取物中比在活细胞中更能有效发现，药物浓度设7个梯度。
分析策略：建立一个基于机器学习的复合评分(LiP-Quant评分)，包括四个评分成分，最主要的是药物剂量-响应曲线的相关性(R2)(占LiP-Quant评分权重的69%，Ⅰ)。此外，评分成分还有同一蛋白具有高剂量反应相关性的多肽数量（Ⅲ），药物多个浓度与对照组之间的肽段的差异显著性 (q值)（Ⅳ）等。
结果发现：5个得分最高的LiP-Quant肽被映射到FKBP1A，这使得FKBP1A成为排名最高的候选蛋白靶标，显示了LiP-Quant识别正确药物靶标的能力。
由此，LiP-Quant方法适用于复杂人类蛋白质组的药物靶标识别，并且通过LiP-Quant评分对肽进行排序可以优先确定真正的靶标，减少假阳性鉴定。
为了进一步测试LiP-Quant，本文测试了另一种化合物FK506，该化合物也已知靶向FKBP1A。结果获得了与雷帕霉素非常一致的结果，再次将前5个LiP-Quant肽映射到FKBP1A。
此外，LiP-Quant对其他真核生物同样适用，鉴别酿酒酵母中的雷帕霉素靶标蛋白，其中5个得分最高的肽被映射到已知靶点FRP1。此外，还发现了先前未表征的潜在靶点ARI1和SYEC，它们具有较高的LiP-Quant评分。经过分析，ARI1可能是雷帕霉素的次要靶点，LiP-Quant优先检测直接药物结合蛋白。
3. 对标LiP-Quant靶标识别方法
为了进一步验证LiP-Quant，本文用staurosporine(一种通用激酶抑制剂)测试了该方法，对LiP-Quant和另外两种检测方法TPP和kinobeads进行比较。
结果发现：LiP-Quant在顶级候选蛋白靶标中鉴别出真阳性靶标。总体而言，LiP-Quant和TPP方法发现的真阳性靶标数量是相当的，尽管TPP比LiP-Quant更敏感，而LiP-Quant具有肽水平的分辨率，可以识别药物结合位点。kinobeads方法捕获的激酶明显多于TPP和LiP-Quant，是一种基于富集的方法。三种方法仅检测到6个激酶重叠，表明它们是互补的。
值得注意的是，高序列覆盖率对于LiP-Quant在药物靶点识别中是至关重要的。为了提高序列覆盖率，文章采用了更长的LC-MS梯度方法，称之为“Deep LiP-Quant”。经过这种方法处理后，发现靶标识别的性能得到了显著提升。其AUC值从0.76上升至0.81，同时激酶靶点数量也从21个增加到了36个，增幅达到42%。
值得指出的是，传统的LiP-Quant方法可能对膜蛋白存在固有的偏见，因为在进行LiP处理前，通常会提取总蛋白，而离心过程可能会导致一部分膜蛋白的损失。为了克服这一问题，文章采用了质膜蛋白富集策略，成功鉴定了大约400种与膜相关的蛋白，这些蛋白在LiP-Quant方法中均得到了100%的富集。借助于这一改进的提取方案，不仅增加了膜蛋白的检测覆盖率，还成功鉴定了钠/钾转运质膜泵(ATP1A1)的α亚基，这是药物proscillaridin A的已知靶标。这些发现突显了，通过采样优化和深度质谱分析或先进的分离技术，可以显著提高LiP-Quant的灵敏度和蛋白质组覆盖率。
4. LiP-Quant成功区分高度同源靶点的药物结合亲和力
接下来，本文重点关注激酶和磷酸酶作为药物靶点。这类靶标的一个共同问题是它们的可变选择性，因为其中一些药物在细胞中有不止一种蛋白质靶标，并且经常以不同的亲和力与它们结合，因此，表征这些细微的差异以确定特定的作用模式是很重要的。在LiP-Quant实验中，可以直接从细胞提取物中确定药物结合亲和力，通过观察最大LiP-Quant信号50%变化的药物浓度(EC50)。
首先，研究了激酶抑制剂selumetinib，确定了6个与MAPK2K1和MAP2K2相关的肽，这是该药物的已知靶点，说明LiP-Quant是一种针对不同特异性药物靶点的灵敏方法。
5. LiP-Quant肽确定药物结合位置
样本策略：HeLa蛋白质组提取物
药物结合位置分析：用雷帕霉素、FK506、selumetinib、staurosporine、fostriecin和calyculin A测定的已知药物靶点的三个得分最高的LiP-Quant肽。
对这些蛋白质结构可用的蛋白质-药物复合物进行了编译，从所有实验中总共得到了7种蛋白质。计算三个LiP-Quant肽的原子的质量中心，作为化合物结合位点的近似位置的参考。质心被表示为具有几何坐标的点。在分析的所有已知案例中，除了calyculin a和fostriecin外，该参考点周围的氨基酸与药物配体之间的距离都在范德华距离4 Å内。基于这些观察，得出结论，可以使用质心三角测量方法来估计药物结合位点。
6. LiP-Quant应用于发现未知靶标，助力解释未知的药物作用模式
鉴于LiP-Quant能够识别和表征药物靶点及其结合位点，将其应用于具有未知靶点的杀菌剂化合物BAYE-004的研究。这种先导化合物以前被发现可以抑制番茄灰霉病的细胞生长。使用LiP-Quant，确定了两种激酶作为BAYE-004的潜在靶标，包括Bcin06g02870。进一步测试Bcin06g02870是否是该化合物的主要直接靶点，使用表达his标记版本Bcin06g02870的B. cinerea细胞系。细胞热转移试验（CETSA)表明，该蛋白经BAYE-004处理后在体内热稳定，证实该化合物与Bcin06g02870结合。
假定的药物结合位点位于Bcin06g02870的ATP结合位点，这也是激酶抑制剂的常见结合位点。最后，进行了LANCE Ultra kinase assay (Perkin Elmer)以测量纯化的MBP标记版本的Bcin06g02870在肽底物上的磷酸化活性。发现BAYE-004抑制Bcin06g02870活性，证实了所鉴定靶标的相关性。
综上所述，使用LiP-Quant鉴定了一种以前未表征的研究用杀菌剂的直接结合靶标，为以前未知的药物作用模式提供了潜在的解释。
总结讨论
本文表明LiP-Quant有效地识别了蛋白质-药物靶点，表征了它们跨物种和药物靶点类别的结合特性，包括激酶、磷酸酶、调节蛋白和膜蛋白，并精确定位了变构或催化性质的药物结合区域。已经证明，LiP方法在人类细胞裂解物中非常稳健，也可以在活细胞中进一步发展，以及靶向质膜蛋白。我们设想TPP和LiP-Quant将在未来联合使用，以实现对药物蛋白质组的更全面覆盖。这些功能使LiP-Quant成为一个强大的靶标鉴别策略，有可能成为化学蛋白质组学工具箱和药物发现流程的重要组成部分。