--- title: "Mann的数据好真的是因为质谱和你不一样？看看不升级质谱如何轻松做到2小时定量8000蛋白" author: "omicsolution" account: "omicsolution" published_at: "2020-11-23T16:33:23+08:00" captured_at: "2026-08-24T11:50:16.750355+08:00" source_url: "https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI2MTI5NDAzNg==&mid=100001266&idx=1&sn=a42b8d54625eaf1c8ebba15c8aea1b42&chksm=6a5dd7495d2a5e5f73042451ae9a242297f32e0ba4f58b2b9aa63fd345b56f0a4210b71a7b59#rd" --- # Mann的数据好真的是因为质谱和你不一样？看看不升级质谱如何轻松做到2小时定量8000蛋白 本文相关数据易算将于2020年12月4日在西湖大学举办的 第二届西湖临床质谱研讨会中详细介绍，欢迎大家届时来我们展台咨询了解。 Matthias Mann教授的蛋白质组数据经常被我们拿来膜拜、对比、效仿。他用的色谱柱填料、质谱参数、质谱方法、分析思路也是我们逐字逐句学习的教科书。 在我们用了他的填料、质谱参数、检测方法后，经常会发现我们的结果依然不如他，于是圈中纷纷流行起这么一个说法：Mann的质谱和我们的只是外观一样，里面都不一样。笔者无法钻进Mann的质谱里一探究竟，但可以为大家揭开Mann的结果优秀而我们很少注意到的另一个问题：样品制备。 在近几年Mann的文章中经常出现的一个前处理方法是：PreOmics iST，该方法源自Mann自己发表的Nature Method文章 ![图片 1](images/001.png) 它的原理一点也不神秘，和众多一体化样品制备的路线大同小异，最大的区别就是，它商品化了，Mann也是天天在用。 ![图片 2](images/002.png) 因此该方法往往被认为和平时各个实验室自行操作用的传统方法大同小异，何必徒增成本呢？ 我之前也是这么想的，直到最近收到测试kit和配套设备PreON后才拨云见日，原来差别真的很大。 下面直接上干货！ 测试条件 我们利用现有材料和机时空余，做了如下测试对比，FASP或TCA对比处理均由客户课题组多年经验的工作人员手动完成进行对比，iST均由配套自动工作站PreON无干涉全自动化完成，均等量上机。 所有数据均单针nano-LCMS采集、定性、定量，DIA数据不进行谱图库匹配，只用DirectDIA分析。 如您想自行下载分析，可以通过点击最下方原文链接下载。 Hela细胞系以及更加优化的条件下的极限测试正在进行中，我们会定期在公众号中更新我们的最新结果。 测试对象 测试仪器 梯度 Min 采集方式 样品分组 人血浆 FAIMS Exploris 480 60 DDA 45CV FASP Thermo Top14 - FASP PreON iST-BCT 小鼠视网膜 Lumos 140 Direct DIA PreON iST TCA 人血浆结果 我们采用2种状态人血浆，各2个生物学重复，DDA非标（不做Match between run），质控标准为1%PSM，1%Peptide，1%ProteinGroup FDR，分析软件为SpectroMine，全部默认参数，数据库为Swissprot human 2020年7月版本，共约20400条序列 下面几张图，样品顺序均一致，从左到右依次是FASP Top14去高丰度 S2组2重复，S4组2重复，FASP S2组2重复，S4组2重复，PreON BCT S2组 2重复，S4组2重复 ![图片 3](images/003.png) 可以看到iST方法做到了远高于人工处理FASP步骤的鉴定结果。PSM数量最多，蛋白略少于去高丰度方法，但总体鉴定率更优。在常规的1小时非标结果中也可以轻松实现最严格质控标准下400PG的数量。 ![图片 4](images/004.png) 样品组别 Top14 S2 Top14 S4 FASP S2 FASP S4 PREON S2 PREON S4 定量相关性Correl 0.62 0.75 0.80 0.83 0.85 0.87 定量蛋白丰度热图和相关性系数分析可以看到，PreON-iST结果的生物学个体重复的定量结果相关性也优于人工处理。 定性质控 样品制备步骤的不可靠会带来各种各样的影响，漏切率、非特异性酶切、非特异性还原烷基化、高比例的氧化、脱酰胺化、非自然的N末端修饰、盐污染等等都是影响最终结果的意外因素。对此我们也进行了评价，质控标准为1%Peptide，1%ProteinGroup FDR，分析软件为pFind，数据库同上。结果如下表： ![图片 5](images/005.png) 尽管可以通过培训、方法优化减少人工处理的意外因素，但人员流动，多人平行处理，试剂耗材批次和重复劳动疲劳等带来的可靠性问题依然无法消除。PreON将所有问题一并解决，再无后顾之忧，大样本处理不再成为您的苦恼。 小鼠视网膜结果 有人觉得自己并没有最新的FAIMS 480仪器，是不是就无能为力了呢？答案是：错！ 我们分别采用小鼠视网膜，2种状态，各3个生物学重复，对比常规丙酮沉淀提取和PreON-iST方法，质谱采用Thermo Lumos，120分钟梯度，均采用DirectDIA定量，质控标准为1%Peptide，1%ProteinGroup FDR，分析软件为Spectronaut，全部默认参数。Uniprot Mouse proteome one gene one protein 数据库，22282条序列。 下面几张图，样品顺序均一致，从左到右依次是iST C组3重复，H组3重复，TCA C组3重复，H组3重复 ![图片 6](images/006.png) 我们可以看到无论ProteinGroup还是Peptide数量，iST均远远优于TCA方法，显示出该方法不仅仅能够更深度的覆盖目标样品的蛋白质组，更在肽段水平提供了丰富的可定量信息。 我们进一步查询了近几年相关研究的结果，可以发现该定量结果提供了远超传统方法的覆盖深度 文献 发表时间 定量方法 仪器 定量Protein Group 10.1038/s41598-019-51777-7 2019 单针SWATH 5600 3257 10.1002/jcb.29822 2020 TMT10 MS3 分级 Fusion 4304 10.1016/j.jprot.2020.103682 2020 TMT10 分级 QE plus 7286 仅pep 1%FDR 10.1021/pr500558y 2014 iTRAQ 分级 5600 3882 10.1167/iovs.19-27328 2019 单针SWATH 5600 1300 10.1007/s12035-019-1479-4 2019 TMT10 分级 QE 2100 iST 测试 2020 单针DIA Lumos 8300 定量质控 和血液分析结果类似，漏切率进一步降低为4-6%，非特异性酶切<1%，非特异性烷基化0。 定性效果超群，那么定量效果如何呢？ ![图片 7](images/007.jpg) 未归一化前，定量信号分布，最高与最低信号差异不超过20% ![图片 8](images/008.png) 组内定量相关性系数均大于0.95 ![图片 9](images/009.png) 各样品蛋白质定量强度分布一致，缺失值情况均<10% （蛋白水平定量值采用Top3 肽段强度中位数Log10信号，纵坐标为蛋白Id，横坐标不同样品，黄色到蓝色代表高丰度到低丰度） ![图片 10](images/010.png) ![图片 11](images/011.png) 从上往下依次为12个测试样品TIC，可以发现总的TIC差异不大，但结果却差距明显。 那么iST比传统方法多鉴定蛋白可能的原因是什么呢？我们从蛋白分类上进行了分析，发现两者并无明显区别，而从各个蛋白的定量信号强度分析，见下图 ![图片 12](images/012.png) 可以发现大部分蛋白的信号强度两种方法基本相似，但中低丰度蛋白明显iST方法得率会更好些。我们在原文链接中也放了定量蛋白列表，感兴趣的老师也可以帮助我们总结下是否存在我们还未考虑到的因素哦。 心动不如行动 现在，易算和PreOmics携手将Mann的一大利器带进中国，让Mann的数据不再神秘，您，也一样可以做到相似的结果。 ![图片 13](images/013.png) iST商品化试剂盒外观 iST试剂盒包括裂解、还原、烷基化、酶解、除盐清洗步骤所需所有试剂，操作量从1微克-100微克蛋白，兼容常规鉴定、非标记定量和TMT标记定量步骤 ![图片 14](images/014.png) 配套自动化工作站PreON外观，高81 cm，宽 65 cm，深 62cm，放在实验台上使用即可。 iST兼容样品类型 ![图片 15](images/015.png) 其中iST及其改进版本BCT,iST-NHS均可和PreON自动移液工作站联用 iST-NHS试剂盒降低TMT标记工作量和标记风险 标记定量实验增加了额外的步骤，高昂的成本和潜在的标记效率问题让初学者望而却步，iST-NHS试剂盒解决您的后顾之忧。快速高效的将TMT标记和iST处理合二为一，总时间仅需3小时即能完成从蛋白裂解到标记上机前所有步骤。 ![图片 16](images/016.png) ![图片 17](images/017.png) iST试剂盒2020年部分文献 - Hörnberg, H., Pérez-Garci, E., Schreiner, D. et al.(Nature 2020) Rescue of oxytocin response and social behaviour in a mouse model of autism. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2563-7 - Djeghloul, D., Patel, B., Kramer, H. et al.(Nature Comm 2020) Identifying proteins bound to native mitotic ESC chromosomes reveals chromatin repressors are important for compaction. https://doi.org/10.1038/s41467-020-17823-z - Blume, J.E., Manning, W.C., Troiano, G. et al.(Nature Comm 2020) Rapid, deep and precise profiling of the plasma proteome with multi-nanoparticle protein corona. https://doi.org/10.1038/s41467-020-17033-7 - Mueller et al.(Nature 2020) The proteome landscape of the kingdoms of life. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x - Bader et al.(Mol Sys Bio 2020) Proteome profiling in cerebrospinal fluid revealsnovel biomarkers of Alzheimer’s disease. https://www.embopress.org/doi/10.15252/msb.20199356 - Zaugg et al.(FASEB Journal 2020) Gestational diabetes mellitus affects placental iron homeostasis: Mechanism and clinical implications. https://faseb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1096/fj.201903054R iST试剂盒和PreON工作站技术路线 ![图片 18](images/018.png) 采用手工操作iST试剂盒仅需约2小时即能完成从蛋白、细胞、体液到肽段的步骤，而进一步采用配套PreON自动化移液工作站，手工时间更是压缩到极致的几分钟。兼容iST，或者NHS-iST步骤。 iST联用自动化工作站PreON，如虎添翼 通过可靠耐用的机械臂自动移液，将加样、吸液、离心、混匀、加热等操作全部整合在一台小巧的桌面工作站中，为您解决所有前处理烦恼。与目前市面上的96孔移液工作站方案相比，PreON的特点在于：灵活、易用、全自动， 但通量相对较低，可以最多同时处理12个样品。如果您对高通量处理感兴趣，可以选用iST/NHS 96孔板方案，通过12通道排枪操作，亦可轻松实现高通量提取。 ![图片 19](images/019.png) PreON功能区布局 ![图片 20](images/020.png) 害怕移液工作站的复杂操作和维护难度？PreON让你无此后顾之忧，PREON的硬件设计摒弃了移液工作站繁琐、复杂、低可靠性的路线。采用单通道机械臂+离心机策略，高度可靠稳定。 同时学习成本极低，从拆箱到培训时间仅需1-2小时，上午拆箱，下午即可拿到您的多肽。方法升级由官方发布补丁升级完成，无须现场调试。 PREON致力于提供灵活易用也最符合当前蛋白质组定性、定量需求的解决方案。因此针对目前最常用的定性、DIA定量、TMT定量专门开发了样品处理步骤和配套试剂盒。这些试剂盒即可手动单独操作也可以直接放入PreON，开机即用。 只需在控制面板上点击样品制备路线，选择酶切时间就完成了所有步骤。 综上，我们可以看到无论定性覆盖深度，还是定量结果一致性，PreON均表现出色，完全可以助您解开Mann的数据为何如此之好的谜团。 看到这里还不动心么？联系我们测试demo或者获取以上测试数据吧。也可以先看看官方的Demo录像有个直观感受： iST在售产品列表 iST 手工操作试剂盒 试剂盒名称 货号 用途 规格 Phoenix多肽清洗 P.O.00023 清洗含色素、去垢剂的多肽样品 96孔板 iST 8x P.O.00001 手动 iST 样品制备试剂盒 8个样品 iST 96x P.O.00027 手动96孔板iST样品制备试剂盒 96个孔板 iST-HT 192x P.O.00067 手动2x96孔板iST样品制备试剂盒 2个96孔板 iST-BCT 8x* P.O.00084 手动BCT样品制备试剂盒 8个样品 iST-BCT 96x* P.O.00099 手动96孔板BCT样品制备试剂盒 96个孔板 iST-NHS 12x P.O.00026 手动iST TMT标记样品制备试剂盒 12个样品 iST-NHS 96x P.O.00030 手动96孔板 iST TMT标记样品制备试剂盒 96孔板 *BCT为iST最新改进规格，改善了血液分析效果，降低了氧化修饰比例，其余性能一致，同样兼容PreON工作站 PreON配套iST试剂盒及耗材 试剂盒名称 货号 用途 规格 专用枪头盒 P.O.00091 PreON移液用枪头 1024个 iST PreON 8x P.O.00077 iST 样品制备试剂盒 8个样品 iST PreON 96x P.O.00079 iST 样品制备试剂盒 96个样品 iST-NHS PreON 12x P.O.00078 iST TMT标记样品制备试剂盒 12个样品 iST-NHS PreON 96x P.O.00080 iST TMT标记样品制备试剂盒 96个样品 围绕DIA定量技术，易算提供了一系列解决方案： - 样品制备 PreOn 蛋白质组专用前处理工作站 Mann的首选，PreOmics iST与Spectronaut强强联手打造DIA最佳上下游方案 - 色谱分离 即插即用，性能卓越 Ionopticks色谱柱值得拥有 - 数据分析 起飞，Spectronaut 14 测评 - 质量评估 利用QuiC3软件对您的质谱数据进行多层次质控 - 生信分析 悟空云2020年10月更新日志 如有您进一步咨询需求和采购意向。 欢迎和我们联系 www.omicsolution.com 若有任何疑问，欢迎邮件或来电咨询： marketing@omicsolution.com support@omicsolution.com +86-18221381405